Isolamento di cellule della cavità peritoneale mouse
Summary
La cavità peritoneale nei mammiferi contiene diverse popolazioni di cellule immunitarie cruciali per risposte immunitarie innate. Un metodo efficiente isolamento è necessario per le analisi biochimiche e funzionali di queste cellule. Qui forniamo un metodo completo per l'isolamento di cellule cavità peritoneale nel topo.
Abstract
La cavità peritoneale è una cavità legata alla membrana e piene di liquido addominale di mammiferi, che contiene il fegato, nella milza, la maggior parte del tratto gastro-intestinale e altre viscere. Si porti un certo numero di cellule immunitarie tra cui i macrofagi, le cellule B e le cellule T. La presenza di un elevato numero di macrofagi ingenuo nella cavità peritoneale rende un luogo preferito per la raccolta dei macrofagi residenti ingenuo dei tessuti (1). La cavità peritoneale è importante anche per lo studio delle cellule B a causa della presenza di un unico cavità peritoneale residenti sottoinsieme B cellule conosciute come cellule B1, oltre alle cellule B2 convenzionali. Celle B1 sono suddivise in celle B1a e B1b, che si distingue per l'espressione di superficie di CD11b e CD5. Celle B1 sono una fonte importante di IgM fisiche che forniscono protezione precoce da una varietà di agenti patogeni (2-4). Queste cellule sono autoreattivi in natura (5), ma come vengono controllati per evitare che l'autoimmunità non è ancora compresa del tutto. Al contrario, CD5<sup> +</sup> B1a cellule possiedono alcune proprietà normativo in virtù della loro capacità di IL-10 produce (6). Pertanto, le cellule B1 cavità peritoneale sono una popolazione di cellule interessante da studiare a causa della loro funzione diverse e molte domande senza indirizzo associati al loro sviluppo e regolamentazione. L'isolamento di cavità peritoneale cellule immunitarie residenti è difficile a causa della mancanza di una struttura definita all'interno della cavità peritoneale. Il nostro protocollo si descrive una procedura per ottenere vitali cellule immunitarie dalla cavità peritoneale di topi, che poi può essere utilizzato per l'analisi fenotipica mediante citometria di flusso e di diversi saggi biochimici e immunologici.
Protocol
Discussion
Isolamento di cellule cavità peritoneale è una tecnica importante per lo studio delle diverse cellule del sistema immunitario, principalmente i macrofagi e specifici sottoinsiemi delle cellule B. Anche se questo è un processo semplice, ci sono alcuni passaggi critici coinvolti. Presenza di contaminanti nel sangue raccolto il campione deve essere evitato per ottenere una pura cavità peritoneale popolazione di cellule. Eutanasia per dislocazione cervicale dovrebbe essere fatto con attenzione per evitare la contaminazione del sangue nella cavità peritoneale. In alternativa CO 2 può essere utilizzato. Inoltre, durante la cura corretta procedura da adottare per evitare la puntura della vescica o degli altri organi nella cavità peritoneale. Recuperare la maggior parte del liquido iniettato è importante anche per il rendimento della cella.
Questa procedura è ampiamente utilizzato per studiare la biologia dei macrofagi dal numero moderato di residenti, i macrofagi non stimolate possono essere facilmente ottenuto dalla cavità peritoneale, in contrasto con il laborioso compito di differenziazione delle cellule progenitrici mieloidi in macrofagi maturi in vitro, utilizzando fattore stimolante le colonie di macrofagi (8 , 9). La resa dei macrofagi dalla cavità peritoneale può essere migliorata utilizzando il metodo di elicitazione Thioglycollate, anche se l'uso Thioglycollate potrebbero alterare le proprietà fisiologiche dei macrofagi (7).
Cellule B sono una parte importante del nostro sistema immunitario giocare un ruolo cruciale sia l'immunità innata e adattativa. Tra le diverse sottopopolazioni di linfociti B, cellule B1 costituiscono un particolare sottogruppo di cellule B coinvolte nell'immunità innata, autoimmunità e regolazione del sistema immunitario. Celle B1 sono principalmente situati nella cavità peritoneale e rifornimento di auto. Si tratta di uno dei produttori primari di IgM naturali che fornisce la prima linea di protezione contro un certo numero di virus e batteri (10-12). Celle B1 sono anche una fonte importante di IL-10 (6), che è una citochina importante coinvolte nella regolazione del sistema immunitario. Anche se diversi studi sono stati perseguiti con le cellule B1, c'è ancora spazio per un'ulteriore valutazione delle loro funzioni contrastanti, specialmente il loro ruolo regolatore. Cavità peritoneale di cellule metodo isolamento offre l'opportunità unica di studiare le funzioni delle cellule B1.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH concedere AI069358 e la Fondazione di Ricerca BloodCenter.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD BBL | 211716 |
Referencias
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O’Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
