Een In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Post-etikettering en metingen met behulp van BD calceïne AM fluorescerende kleurstof Cellen worden gelabeld voor kwantificering nadat ze zijn binnengedrongen via de BD Matrigel Matrix en doorgegeven via de BD FluoroBlok membraan. Als gevolg hiervan kan alleen eindpunt meting van de cel invasie worden verkregen. Grow-cellen tot ~ 80% confluentie. Voor te bereiden en te rehydrateren de insert-systeem. Verwijder de verpakking van -20 ° C opslag en laat deze op kamertemperatuur komen. Open de folie verpakking en voeg 500 ul warm (37 ° C) media om de binnenkant van de insert putten. Laat de plaat gedurende 2 uur hydrateren bij 37 ° C, 5% CO 2. Opmerking: Het is niet nodig om de ongecoate BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Systeem dat gebruikt zal worden als een cel migratie controle te hydrateren. Na rehydratie, verwijder het medium van de insert putten zonder de laag van BD Matrigel Matrix op het membraan. Het systeem is nu klaar voor gebruik. Bereid celsuspensies door trypsinizing celmonolagen en resuspenderen de cellen in serum-vrij DMEM bij 5 x 10 4 cellen / ml. Opmerking: Als u gebruik maakt van een andere cel type dat u nodig hebt om het optimale zaaien dichtheid te bepalen. Voor het bepalen van de optimale dichtheid van zaaien voor je mobiele typen op een poreuze ondergrond groei, gebruik van een scala van zaaien dichtheden (cellen / cm 2) dat tussen haakjes het zaaien dichtheid gebruikt op niet-poreuze ondergronden (bv. flessen, schalen en borden). Bijvoorbeeld, als je op dit moment zaad op 2,5 x 10 5 cellen / cm 2, zaad op verschillende cel concentraties tussen 5 x 10 4 en 5 x 10 5 cellen / cm 2 om de optimale eerste seeding dichtheid te bepalen. Voeg 500 ul van celsuspensie (2,5 x 10 4 cellen) aan de apicale kamers. Voeg 750 ul van chemoattractant (5% FBS in DMEM) aan elk van de basale kamers, met behulp van de steekproef poorten voor toegang. Incubeer de BD BioCoat tumorinvasie System en de ongecoate BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate voor 20-22 uur bij 37 ° C, 5% CO 2 atmosfeer. Na de incubatie, verwijder voorzichtig medium van de apicale kamers. Dit kan worden bereikt door flicking de inhoud in een afvalbak. Raak de onderkant van de insert-systeem. Overdracht van de insert-systeem in een tweede 24-wells plaat met 500 ul / putje van 4 ng / mL Calceïne AM in HBSS. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. De Calceïne AM oplossing is niet verwijderd uit de Tweede Kamer vóór het lezen van fluorescentie want het is een nonfluorescent vitale kleurstof die in het groen fluorescent calceïne omgezet door cytosolische esterases. Fluorescentie van binnengevallen cellen wordt afgelezen op golflengten van 494 / 517 nm (Ex / Em) op een bottom-het lezen van fluorescerende plaat lezer. De winst instelling kan nodig zijn om empirisch worden bepaald, maar een middelpunt te krijgen moet een voldoende uitgangspunt. Een winst instelling die te hoog is kan leiden tot verzadiging van de detector met zeer fluorescerende monster, dit kan de overname van zinvolle resultaten te voorkomen. Gebruik van de Automatische versterkingsregeling (indien ondersteund op uw lezer) wordt niet aanbevolen. Een omgekeerde fluorescentie microscoop kan worden gebruikt om uw resultaten te verifiëren, het is vooral nuttig om dit te doen de eerste keer dat u deze test. Opmerking: Het is van het grootste belang dat de Insert-systemen worden gelezen met behulp van de juiste plaat kaart. Voor informatie over het laden plaat kaarten te zien BD Technical Bulletin No 436 op www.bdbiosciences.com of neem contact op BD Technical Support (labware@bd.com). Een goede plaat oriëntatie is met een goed A1 bij de linker bovenhoek en de BD Flacon logo gericht op rechts, zoals de plaat wordt geplaatst in de lezer. Datareductie Worden uitgedrukt als in de volgende vergelijking: Achtergrond kan worden afgetrokken voor de berekening van de cel procent invasie RFU = relatieve TL-eenheden.