Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

Parte A: Soluções de congelamento de esperma 1. Peixe Ginsberg Ringers (Faça novo a cada 3 dias; Ginsburg, 1963) NOTA: ordem de adição é importante para evitar PRECIPITAÇÃO Em 450 ml estéril ddH2O dissolver: NaCl 3,25 g KCl 0,125 g CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Em seguida, acrescentar: NaHCO3 0,10 g Trazer um volume final de 500 ml com ddH2O estéril e armazenar a 4 ° C. 2. Médio congelamento (Faça diária fresco) SEM Metanol Peixe Ginsburg Ringers 10 ml (temperatura ambiente). Leite em pó desnatado 1,5 gm Com metanol NOTA: ordem de adição é importante para evitar PRECIPITAÇÃO Peixe Ginsburg Ringers 9 ml (temperatura ambiente). 1 ml de metanol Leite em pó desnatado 1,5 g Depois de montar media congelamento, misture bem por 20 min. em agitador orbital ou rocker. Antes de usar, alíquota em 1 ml tubos eppendorf, evitando bolhas de superfície. Parte B: Materiais necessários para o congelamento de esperma Materiais necessários para o congelamento de esperma 10 ml Pipetas descartáveis ​​(Fisherbrand # cat 22-358697) Copos de 250ml de água de peixe contendo MESAB / tricaina vidros de relógio (Pyrex cat # 9985-75) P20 Pipetman (ou equivalente) e dicas Esponja titular de peixe (para segurar enquanto aperta masculino) Dissecando microscópio com iluminação de palco acima Forceps plana (por exemplo, tipo Millipore) 2,0 ml frascos criogênicos (Corning cat # 430488) 10X10 cryoboxes (Nalgene gato # 03-337-7AA) Isopor recipiente com ~ 15 cm de finamente trituradas ICE1 seca 15 ml cônico tubos (Falcon # 352099) Dewar frasco contendo nitrogênio líquido Pinças longas (por exemplo, CMS Fisher gato Cuidados de Saúde n º 10-316B) Cryogloves Tanque de recuperação para os homens Um tubo eppendorf cheia de mídia congelamento sem metanol Um tubo eppendorf preenchido com media de congelamento com metanol Cryofreezer (eg Taylor-Warton K-series) 1 Um método simples para fazer finamente trituradas gelo seco é envolvê-la em uma toalha e pulverizá-la com um martelo. Um método mais eficiente é usar um moedor de gelo seco, por exemplo, modelo Clawson RE-2. Parte C: método de congelamento de esperma MARK TUBOS CAPILARES: Antes de começar, marque a tubos capilares 10μl com uma caneta de laboratório ao nível de 3,33 mL (ou seja, 16,7 milímetros de baixo, ver Fig. 1.1.). Anestesiar MASCULINO: masculino Place (s) no copo contendo MESAB / tricaina diluído em água de peixe (receita em "O Livro dos Zebrafish") PEIXE SECO: Uma vez anestesiados, levante peixe fora de anestésico usando uma colher de plástico e suavemente blot peixe seco numa toalha de papel, com especial atenção para a secagem do lado ventral. Água ativa de esperma por isso é importante para secar completamente em torno da cloaca. Peixes posição no suporte de esponja, acima do lado ventral (Fig. 1.2). Se região em torno de barbatana anal é ainda úmida, secar delicadamente com uma kimwipe. Tome cuidado para não apertar o esperma prematuramente! Lugar marcado tubo capilar em borracha adaptador pipeta boca que está incluído com tubos capilares. O adaptador é uma mangueira de borracha que tem um bocal em uma extremidade e um suporte capilar, de outro. Alternativamente, o tubo capilar pode ser conectado a uma seringa Hamilton 50μl através de um pequeno pedaço de tubo de tygon do diâmetro apropriado. Masculino lugar no âmbito e expor a abertura urogenital, cuidadosamente espalhar as barbatanas pélvicas além usando a extremidade do tubo capilar. Coletar esperma: esperma por expulsar gentilmente acariciando os lados do peixe com uma pinça suave (por exemplo, Millipore), ou apertando suavemente os lados do peixe entre o dedo indicador eo polegar. Coletar o esperma em tubo capilar, uma vez que é expelido através de sucção suave (Fig. 1.2). Evite fezes que pode ser expulso com o esperma. Normalizar o volume esperma para 3,3 mL: Se o volume de esperma atinge ou ultrapassa marca de caneta no tubo capilar (ou seja, 16,7 milímetros ou mais), então vá para a etapa 8. Se o volume do esperma não atingir o volume alvo, então normalizar o volume para marcar caneta usando Médio congelar sem metanol (Fig. 1.3). Quantidade mínima de esperma que é aceitável varia com a qualidade do esperma. Esperma bom é branco e opaco. Escassa de esperma parece aguado. Em geral, aceitamos como mínimos: 1 mL de esperma bom (ou 1 / 3 da meta) e 2 mL de esperma pobres (ou dois terços da meta). Volume agora é normalizada para 3,3 mL. ADD crioprotetor ao esperma: Suck up Medium congelação com Metanol para a marca laranja (aprox. volume total é agora 20 l;. Fig 1.4). Expulsar mistura de esperma e crioprotetor em área limpa de um vidro de relógio, com especial atenção para não introduzir bolhas. Misture suavemente pipetando cima e para baixo ~ 4 vezes (evitar a introdução de bolhas). LOCAL DE ESPERMA 10μl em cada um dos dois criotubos: Pipetar 10 mL do esperma: solução crioprotetor no fundo de duas criotubos separados que têm sido rotuladas com a informação relevante (Fig. 1.5). Movendo-se rapidamente, frascos de tampa e coloque-os na parte inferior da temperatura ambiente de 15 ml tubos Falcon e um cryovial / tubo. Tampa do tubo Falcon e insira o par de tubos cryovial contendo Falcon em gelo seco esmagado. FREEZE ESPERMA DE 20 MIN. Em gelo seco: O gelo seco deve ser em forma de pó fino, não pellets. Os tubos devem ser inseridos no gelo seco profundo o suficiente para que apenas seus limites show (Fig. 1.6). , A fim de manter o controle de tubos em gelo seco, dê a cada par de tubos Falcon um número 1-20 (escrito nas tampas) e registrar o tempo eles vão para o gelo seco. Criotubos PLACE em nitrogênio líquido:. Após o esperma foi congelado em gelo seco por 20 min, transferi-los para um contendo nitrogênio líquido frasco de Dewar. O esperma é armazenado aqui até a hora de colocar em freezer de nitrogênio líquido. Ao colocar nas caixas de freezer, caixa de freezer lugar em um banho de nitrogênio líquido para que as amostras não aquecer. Use pinças de metal compridas para recuperar frascos de frasco dewar e lidar com cryogloves. Alternativamente, criotubos podem ser transferidos diretamente de gelo seco na caixa se a caixa de freezer freezer é mantida imersa em nitrogênio líquido em um recipiente de isopor. Criotubos armazenar a longo prazo em um freezer criogênico de nitrogênio líquido. Para manter a viabilidade de espermatozóides, é importante que os frascos são armazenados imersos em nitrogênio líquido. Em nossa experiência, os frascos armazenados na fase vapor perdem viabilidade ao longo do tempo. A velocidade é importante! O tempo entre a adição do crioprotetor e colocando frascos de esperma em gelo seco (ou seja, as etapas 6-10) deve ser superior a 30 seg. Parte D: Método Fertilização In Vitro Utilizando Espermatozóides criopreservados Nós achamos que isso funciona melhor com duas pessoas. Uma pessoa aperta os ovos de fêmeas, enquanto que a outra pessoa derrete o esperma. Definir um banho de água a 33 ° C. Retire do freezer cryovial nitrogênio líquido e transferência para nitrogênio líquido contendo frasco dewar até estar pronto para descongelar. Squeeze ovos de fêmeas em 35 milímetros placa de Petri de plástico. Se possível, tente obter três garras de ovos e combinam em um prato. Se você não pode obter três garras bem dentro de 1 min de sua primeira embreagem, então vá para a etapa 4 (uma embreagem boa é suficiente). Definição de embreagem boa:> 150 ovos uniformemente bom olhar (amarelada ou seja, sem detritos branco indicativo de degradação). Mantenha prato coberto, enquanto o esperma é descongelado. Remover o frasco de nitrogênio líquido e retire a tampa. Frasco rapidamente mergulhe ~ 1 / 2 caminho em 33 ° C banho de água por 8-10 seg. Adicionar rapidamente 70 mL à temperatura ambiente Hanks para o frasco e misture pipetando para cima e para baixo. Imediatamente adicionar aos ovos e misture delicadamente com a ponta da pipeta. Sem demora, ative o esperma e os ovos, adicionando 750 mL de água de peixe. Agite para misturar. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. Após 5 min, preencha prato com água de peixe e prato de incubar a 28 ° C. Depois de 2-3 horas, contagem e transferência de embriões fértil para pratos de 100mm (50/dish). Contagem de ovos inférteis, para que a fertilização de freqüência pode ser determinada. Cuide bem das larvas! Para os primeiros 5 dias, mudar a água diariamente e eliminar os embriões mortos. Coloque apenas larvas que têm bexigas natatórias em berçário no dia 5. E parte: Resultados Representante Nós usamos esta metodologia crypreservation para fazer uma biblioteca de 8.600 amostras de esperma congelado para lavrar entre os anos de 2001 e 2003. Temos descongelados 106 dessas amostras e determinada a sua fertilidade. Fertilidade é a relação de embriões viáveis ​​produzidos em uma fertilização in vitro no dividido pelo número total de ovos que foram fertilizados com o esperma congelado. Frescos (não cryporeserved) esperma normalmente tem> de fertilidade de 95%; espermatozóides criopreservados tem de fertilidade muito menor: uma média de 29% (n = 106 frascos). A variabilidade de frasco para frasco de fertilidade é grande, variando de menos de 1% para tão alto quanto 62%. Esta variabilidade é representada pelas barras de erro representam grande desvio padrão na Figura. 2. No entanto, em 106 amostras de esperma descongelado até à data temos apenas uma vez experimentado 0% de fertilidade tanto em amostras de esperma e não conseguiu recuperar a mutação Tilling correspondente. Pelo descongelamento frascos de esperma da nossa biblioteca ao longo de vários anos (2001-2008), descobrimos que a fertilidade média de amostras de esperma congelado por este método permaneceestável ao longo do tempo (Fig. 2). A fecundidade média das amostras de esperma congelado descongeladas em 2001 foi de 23,5% (com base em 11 amostras de esperma) e em 2008 foi de 25% (com base em 21 amostras de esperma). Uma série de outros pesquisadores agora estão usando esse protocolo de congelamento de esperma em seus laboratórios. Alguns relataram um bom sucesso com as taxas de fertilidade e amostra-to-sample variabilidade semelhante ao que temos observado. Outros têm supostamente não conseguiu fazer este protocolo de trabalho em suas mãos. Acreditamos que as fontes prováveis ​​de problemas são: A não utilização da criotubos exata ou tubos cônicos que sugerimos no protocolo, levando a uma taxa diferente de refrigeração quando em gelo seco; A não utilização de gelo seco em pó, levando a uma taxa de resfriamento sub-ótima; Usando peixes machos com baixa fertilidade: você deve conseguir pelo menos 1 ml de esperma de um único macho. Você também pode testar a fertilidade masculina, ao fazer uma fertilização in vitro com esperma fresco, no entanto isso pode ser enganador, porque leva muito pouco esperma fresco para chegar perto de 100% de fertilidade. Usando óvulos sub-padrão de qualidade na fertilização in vitro. Usando nada além de embreagens perfeito sempre leva para perto de 0% a fertilidade, mesmo a partir de amostras de esperma que realmente têm boa fertilidade (com base na fertilidade do frasco duplicado). Figura 1. Esquemática da metodologia de congelamento de esperma. Figura 2. Fertilidade de espermatozóides criopreservados permanece estável ao longo do tempo. Fertilidade por cento é o número de embriões viáveis ​​produzidos em uma fertilização in vitro, dividido pelo número total de ovos que foram fertilizados com o esperma congelado. "N" refere-se ao número de frascos de esperma criopreservados cuja fertilidade foi testado no ano correspondente. Barras de erro representam o desvio padrão. Uma vez que cada frasco de esperma de um macho é diferente, frasco-ampola para a variabilidade é observada.