I. Tissue conditioning – Dag 0 Na ontvangst van de EpiDerm EPI-200-SIT kit, controleer alle componenten van de kit voor integriteit (voor kit details zie Tabel van specifieke reagentia en apparatuur). Voor elke drie EpiDerm weefsels, bereiden een steriele 6-well plaat voorgevuld met 0,9 ml van de voedingsbodem. Onder steriele omstandigheden, open de plastic zak met de 24-wells plaat met de EpiDerm weefsels en verwijder het steriele gaas. Gebruik steriele pincet om elke insert met de EpiDerm weefsel te verwijderen en van de insert in het lege 24-wells plaat plaats. Tijdens deze stap, verwijder alle resterende verzendkosten agarose dat aan de buitenkant van de insert kleeft door zachte blotting op steriel filtreerpapier. Binnen de komende vijf minuten, visueel de weefsels. Gebruik geen defecte weefsels of weefsels die volledig bedekt zijn met vloeistof. Met behulp van een steriel wattenstaafje wattenstaafje voorzichtig droog het oppervlak van de weefsels. Probeer niet om het weefsel direct touch – capillaire effecten voldoende zijn om het vocht te verwijderen uit het weefsel oppervlak. Na het drogen van het weefsel oppervlak, transfer drie weefsels naar de bovenste rij van de 6-well platen voorgevuld met 0,9 ml van de voedingsbodem. Laat eventuele luchtbellen gevangen onder de inserts. Plaats de 6-well platen met de inserts in de incubator voor een 60 ± 5 min pre-incubatie bij 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RV (relatieve vochtigheid). Aan het einde van de 60 ± 5 min pre-incubatieperiode, overdracht van de inserts van de bovenste putten in de onderste putten van de 6-wells plaat. Plaats de platen in de incubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RV) voor een overnachting pre-incubatie (18 ± 3 uur). Leg de rest van de voedingsbodem in de koelkast (5 ± 3 ° C). Na de nacht pre-incubatie, kan de test chemicaliën worden toegepast op de EpiDerm weefsels. Opmerking: De pre-incubatie procedure kan worden ingekort in geval van te late levering weefsel (bijvoorbeeld als weefsels aankomst op woensdag in plaats van dinsdag). II. Blootstelling aan chemische stoffen – Dag 1 Bereid een 6-wells plaat per teststof door het vullen van de bovenste rij alleen met 0.9 ml per putje van de voedingsbodem. Ongeveer 5 minuten voor de geplande blootstelling aan chemicaliën, verwijder dan de 6-well platen met de pre-geconditioneerde weefsels van de incubator. Evalueer het oppervlak van weefsels en verwijder alle vocht met behulp van steriele katoenen tips. Label alle 6-wells plaat deksels met het testmateriaal codes of namen. Dosis van de weefsels met de test chemicaliën op intervallen van 1 minuut te faciliteren spoelen van de test chemicaliën na blootstelling. Houd de platen met gedoseerde weefsels in de steriele kap, totdat de laatste weefsel wordt gedoseerd. Om te testen vloeibare chemicaliën, ontheffing 30 pi van de oplossing direct boven op het weefsel en plaats de nylon mesh op de weefsels oppervlak. Indien nodig, voorzichtig de positie van de mesh met behulp van de lamp onder leiding glas Pasteur pipet. Druk niet op het weefsel oppervlak. Voor het testen van halfvaste stoffen, gebruik van een verdringerpomp pipet tot 30 pi direct boven het weefsel afzien. Indien nodig verspreiden van de chemische met Pasteur pipet, om het weefsel oppervlak zo veel mogelijk. Dekken Voor vaste stoffen, kort voor de toepassing van de teststof, bevochtigen het weefsel oppervlak met 25 pi van steriele DPBS. Dit zal contact van het weefsel oppervlak met de teststof. Vul een 25 mg gekalibreerd scherp toepassing lepel (of een ander geschikt instrument) met ongeveer 25 mg van fijn gemalen testmateriaal. Van toepassing zijn de vaste teststof aan het weefsel oppervlak. Indien nodig, gebruik dan een gloeilamp leiding Pasteur pipet om de lepel helemaal leeg. Schud de inserts voor de verspreiding van de vaste op het oppervlak te verbeteren. Voor teststoffen met een wasachtige consistentie, proberen een vlakke "cookie achtige" vorm stuk ongeveer 8 mm in diameter en plaats het boven op het weefsel, die voorheen werd bevochtigd met een steriele DPBS. Ter verbetering van het contact tussen de teststof en weefsel, wegen op de "cookie" met een roestvrij stalen of kunststof hulp. Toe te passen DPBS als de negatieve controle en 5% SDS als de positieve controle van de controle weefsels. Na inname van de laatste weefsel, de overdracht van alle platen van 35 ± 1 minuut aan de bevochtigde incubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH). Na de 35 ± 1 minuut incubatie bij 37 ° C verwijder alle platen uit de couveuse. Leg de platen in de steriele motorkap en wacht tot een periode van 60 minuten blootstelling aan chemische stoffen is voltooid voor de eerste gedoseerd weefsel. Daarna start het wassen met behulp van de een insert per minuut tijdsinterval (tot verzekeringe dat de totale belichtingstijd voor elke insert is 60 minuten). Gebruik een wasfles naar de weefsels te spoelen met steriel DPBS. Vul het weefsel insert 15 keer met behulp van een constante stroom van DPBS en maak dit leeg. (Opmerking: voor weefsels met een nylon mesh, was het weefsel oppervlak 5 keer en verwijder voorzichtig het gaas met de puntige, scherpe tang Daarna verder met de resterende 10 wasbeurten). Na de 15e Spoel met behulp van de wasfles, volledig onderdompelen insert 3 keer in 150 ml DPBS en schud om de rest van het testmateriaal te verwijderen. Ten slotte, wanneer Spoel het weefsel te voegen aan de binnenkant en een keer van buiten met een steriele DPBS. Verwijder eventuele overmaat van DPBS uit het weefsel door voorzichtig schudden van de insert, en blotting het op het steriele vloeipapier. Breng de afgevloeid weefsel voegt aan de nieuwe 6-wells plaat eerder voorgevuld met voedingsbodem. Al deze stappen (14-18) moet worden gedaan binnen 1 minuut voor elke insert. Na de laatste weefsel is gespoeld, zorgvuldig droog het oppervlak van elk weefsel met een steriele katoenen tip wattenstaafje. Incubeer de weefsels in de incubator voor de komende 24 ± 2 uur (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RH). Opmerking: Elke assay technicus mag niet testen meer dan 6 te testen stoffen, met inbegrip van de negatieve en positieve controles in een enkele test run (set), te kunnen volgen het protocol zoals hieronder beschreven III. Medium wisselen – Dag 2 Na de 24 ± 2 uur na de incubatie, de overdracht van de inserts in het onderste deel van de 6-well plaat, vooraf gevuld met 0,9 ml van de media. Media van de bovenste rijen kunnen worden verzameld voor de analyse van de bijkomende eindpunten (cytokines, chemokines, etc.). Analyse van de secundaire eindpunten is optioneel. Ga verder met de post-incubatie (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RV) voor een andere 18 ± 3 uur. IV. MTT Levensvatbaarheid test – Dag 3 Label twee 24-wells platen met de chemische namen of codes. Een plaat zal dienen voor de tissue incubatie met MTT en de andere voor de extractie stap. Bereid de MTT-oplossing door het ontdooien van de MTT concentraat (5 mg / ml) en verdunnen met de MTT verdunningsmiddel. Uiteindelijke concentratie van MTT-oplossing is 1 mg / ml. Pipetteer 300 ul van de MTT-oplossing in elk putje van de 24 wells plaat. Verwijder de 6-well platen van incubator, blot de onderkant van de inserts op een vloeipapier, en breng ze in de 24-wells plaat voorgevuld met MTT. Plaats de 24-wells plaat in de incubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% RV) en incubeer gedurende 3 uur ± 5 minuten. Strikt aan de 3 uur ± 5 min incubatie tijd om afwijking tussen de verschillende MTT metingen te voorkomen. Als de MTT incubatietijd is voltooid, gebruik dan een zuigpomp aan de MTT medium Zuig voorzichtig uit alle bronnen. Vul de putten met DPBS en weer aspireren. Herhaal dit spoelen nog twee keer en zorg ervoor dat de weefsels droog zijn na de laatste aspiratie. Na de overdracht wast de inserts om een nieuwe 24-well plaat. Dompel de inserts door voorzichtig pipetteren 2 ml extractiemiddel oplossing (Isopropanol) in elkaar te voegen. Het niveau zal stijgen boven de bovenste randen van de voegen, dus volledig onder te dompelen de weefsels. Sluit de 24-well plaat (bijv. met Parafilm of met behulp van afdichting zak) om extractiemiddel verdamping te remmen. Extract van de MTT van de weefsels voor minimaal 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden op een bord shaker (~ 120 rpm). 'S nachts extractie zonder schudden kan ook worden gebruikt. Na de extractie periode is voltooid, doorboren de inzetstukken met een injectienaald of bol kralen Pasteur pipet en laat het extract deze in de bron waaruit het insert werd genomen. Gooi de lekke voegen en pipet de oplossing in de put omhoog en omlaag drie keer totdat het homogeen is. Voor elk weefsel, overdracht twee 200 pi aliquots van de paarse formazan oplossing in een 96-well microtiterplaat vlakke bodem. Breng de duplicaten op basis van de vaste plaat ontwerp gegeven in de spreadsheet bij deze video protocol. Voor blanks, gebruik isopropanol. Lees de optische dichtheid (OD) van de MTT extracten in een 96-well plaat spectrofotometer met behulp van een golflengte van 570 nm (540-580) zonder een referentie-filter. Voer de resultaten in de spreadsheet voor automatische berekening van de resultaten (Figuur 1). Een test chemische stof wordt het label "irriterend" (R38 of GHS-categorie 2) als het percentage levensvatbaarheid van het weefsel wordt bepaald door MTT assay is <50% ten opzichte van de negatieve controle. Let op: MTT giftig is, dus zorg ervoor dat beschermende handschoenen te dragen bij het hanteren. Beschermen MTT en zijn zolutions van licht, omdat MTT is lichtgevoelig. Gebruik MTT-oplossing binnen een paar uur na de bereiding, omdat het na verloop van tijd. V. Assay Quality Controls EpiDerm EPI-200-kit SIT Acceptatiecriteria: In vitro RHE-modellen moeten consistente, hoogwaardige gegevens na verloop van tijd, niet alleen tijdens het validatieproces (8). Aanbevolen richtlijnen op lange termijn assay reproduceerbaarheid en prestaties te garanderen onder meer "volledige karakterisering van cellen of weefsels, bemonstering van elke partij … voor prestaties, en het regelmatig gebruik van de controles en benchmark-chemicaliën voor borging van de consistentie van de assay prestaties te leveren" (9) . Naast de test acceptatiecriteria hieronder uiteengezet, elke productie heel veel EpiDerm is de kwaliteitscontrole door de fabrikant getest tegen een extra referentie chemische (1% Triton X-100). De belichtingstijd nodig is om levensvatbaarheid van het weefsel te verminderen tot 50% (ET-50) voor Triton X-100 wordt bepaald. Voor EpiDerm, hebben jaarlijks gemiddelde ET-50-waarden varieerden van 5,9 uur tot 7,5 uur. De partij tot partij CV voor negatieve controle weefsels (dwz de variabiliteit in de referentie levensvatbaarheid) is gemiddeld minder dan 7,5% voor elk jaar sinds 1996. De ET50 waarde van elke productie partij moet binnen twee standaarddeviaties van het historische gemiddelde Triton X-100 ET50 opgericht in 1996 (dat wil zeggen ET-50 = 6,7 uur; Onderste acceptatie limiet = 4.8h; bovenste acceptatie limiet = 8.7h) met het oog worden vrijgegeven voor gebruik door de fabrikant. EPI-200-SIT-assay Acceptatie Criterium 1: Negatieve controle: De absolute OD van de negatieve controle (NC) weefsels (die behandeld worden met steriele DPBS) in de MTT-test is een indicator van de levensvatbaarheid van het weefsel verkregen in het testlaboratorium na verzending en opslag van de procedures en onder specifieke voorwaarden voor het gebruik. De test voldoet aan de aanvaarding criterium als de gemiddelde OD 570 van het NC-weefsels is ≥ 1,0 en ≤ 2,5. EPI-200-SIT Assay Acceptatie Criterium 2: de positieve controle Een 5% SDS (in H 2 O)-oplossing wordt gebruikt als positieve controle (PC) en tegelijkertijd getest met de test chemicaliën. Gelijktijdige betekent dat de pc moet worden getest in elke test, maar niet meer dan een PC nodig per dag testen. Levensvatbaarheid van positieve controle moet worden binnen de 95%-betrouwbaarheidsinterval van de historische gegevens. De test voldoet aan de aanvaarding criterium als het gemiddelde levensvatbaarheid van PC weefsels uitgedrukt als% van de negatieve controle weefsels is 20%. EPI-200-SIT Assay Acceptatie Criterium 3: standaardafwijking (SD) De huidirritatie is voorspeld op basis van de gemiddelde levensvatbaarheid bepaald op 3 single weefsels en dus ook de variabiliteit van weefselmonsters worden aanvaardbaar klein is. De test voldoet aan de aanvaarding criterium als de SD-berekend op basis van individuele% weefsel de levensvatbaarheid van de drie identiek behandeld repliceert is <18%. Representatieve resultaten Figuur 1 De resultaten voor de zes te testen, NC en PC controle. – Een deel van de geautomatiseerde spreadsheet voor de berekening van de resultaten. Test chemicaliën die levensvatbaarheid van het weefsel onder de 50% gerelateerd aan NC verminderd worden als irriterend ingedeeld. De test is geoptimaliseerd om de resultaten die voldoende ver van de indeling cut-off (50% levensvatbaarheid) waardoor de robuustheid van de test geven. Materialen
