Préparation Cell Block de cytologie avec une prédominance de cellules individuellement épars

Introduction: Ceci est une vidéo décrivant la méthode pour la préparation Shidham bloc cellulaire du liquide à base de cytologie (LBC) spécimen à l'aide HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Par rapport à d'autres approches aléatoires, les suivantes sont les deux caractéristiques essentielles de ce protocole pour la préparation de blocs de cellules à partir de spécimens relativement aux seules hypocellulaires dispersés cellules perdent (1-5). Ce protocole comporte des mesures pour concentrer les cellules le long du plan parallèle à la surface de coupe du bloc cellulaire. Il inclut également une intégration comme une balise sombre de AV-marqueur (figure 1b), qui sert à deux fins suivantes: Pour visualiser le niveau auquel les cellules sont concentrées. La zone du bloc de cellules avec les cellules d'intérêt aujourd'hui pourrait être visualisé par l'histotechnologist lorsque la balise de couleur foncée est exposé pendant la coupe. Cette capacité à surveiller les empêche de couper à travers le niveau avec la plupart des cellules, ou ne pas couper trop superficielle dans le niveau avec la plus forte concentration de cellules de l'échantillon. Pour servir comme point de référence de localisation dans la section du bloc cellulaire de série sur les différentes diapositives. Ce point de référence agit comme un phare pour aider à localiser les cellules ou groupes de cellules pour l'évaluation d'un modèle immunoréactivité coordonner avec l'approche SCIP (6,7). PROTOCOLE (figure 2) Préparation de l'échantillon. Transférer le spécimen résiduelle LBC cytologie cervicale à un tube de verre à fond plat (15mm de diamètre x 45mm) (figure 2.1 à 2.4). Placez le tube de verre dans un tube en plastique plus grand transporteur (28 x 85mm) et centrifugeuse. Retirer le tube à fond de verre du tube transporteur et éliminer le surnageant. Le tube de verre est alors plafonné (pour éviter les déversements d'eau de chauffage dans l'étape suivante) et replacé dans un grand tube à fond plat en plastique porteuse Le tube en plastique support contenant le tube de verre est alors plafonné, placé dans une centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, Rayon-17cm de rotor) pendant cinq minutes (figure 2.5). Les tubes sont ensuite retirés à la verticale de la centrifugeuse et le tube de verre plus petit est retiré avec une pince à partir du tube en plastique plus grand transporteur, sans perturber le culot de cellules sédimentées. Le tube en verre avec spécimen est non plafonnés et le surnageant est vidé en prenant soin de ne pas perturber la couche plane de cellules sédimentent au fond (figure 2.6). L'inclusion de la coordonnée de référence AV-marqueur et plus de gel Une balise noire AV-marqueur (environ 2 mm x 2 mm taille, plane surface, fragment de couleur foncée, le matériel sectionnable) (figure 3) est ajouté comme un poteau indicateur sur le tube de verre (Figure 2.7). Liquéfier une aliquote de HG en le fondant au micro-ondes pendant 10 secondes à puissance moyenne. Ajouter 0,5 ml de HG fondu pour le tube, mélanger avec le sédiment rapidement, et il récapitulation (figure 2.8) (Passez à l'étape suivante rapidement sans laisser le HG pour commencer à se solidifier). Ajoutez environ 2,5 ml d'eau tiède (45 ° C) de l'eau dans le tube en plastique de support (Figure 2.9). Le tube de verre plus petit plafonné est placé à l'intérieur du tube en plastique avec de l'eau tiède. (Cette étape est nécessaire pour garder le HG de se solidifier au cours des prochaines étapes) (Figure 2.9). Le tube en plastique transporteur est placé dans la centrifugeuse (avec des tasses et non orientable coupes à angle fixe de sorte que les cellules tomber perpendiculairement au fond plat du tube de verre), et tournant à 1805 G (3000 RPM, le rayon-17cm de rotor) pour cinq minutes. Le but de cette étape de centrifugation est de pousser le marqueur AV et pour concentrer les cellules dans une couche proche de la surface de coupe du bloc cellulaire de paraffine finale embarqués (figure 1d). Les tubes sont ensuite retirés doucement et verticalement à partir de la centrifugeuse en prenant soin de ne pas perturber la couche sédimentée mince avec des cellules de l'échantillon dans le fond. Le tube en plastique est plus non plafonnés et le tube de verre plus petit est retiré verticalement par une pince sans déranger la couche de sédiments de cellules spécimen. Le petit tube de verre est réfrigéré en position verticale pendant 15 minutes pour refroidir et se solidifier l'HG (figure 2.11). Retrait du bloc cellulaire comme un bouton de gel avec un spécimen pour le traitement final Le disque HG solidifié, avec la couche de concentré / sédiments spécimens au fond est délogé du tube de verre à fond plat en injectant formol à 10% grâce à une aiguille de calibre 23 avec la seringue (figure 2.12). L'aiguille est insérée sur le côté du tube à la périphérie du disque de HG solidifié avec éprouvette (figure 2.12). Le needle est tournée sur le côté du tube tout en formol est lentement poussé par la seringue. Il en résulte la séparation de la touche HG avec balise de couleur foncée AV-marqueur et le spécimen concentré dans ce fond plat de la du tube de verre (figure 2.12). Le bloc de cellules (bouton de gel avec des cellules spécimen) est ensuite placé dans une cassette étiquetés et soumis pour le traitement des tissus à préparer des blocs de paraffine cellulaire embarqué (figure 2.13). Intégration et la coupe de l'échantillon Le disque est inclus dans la paraffine avec le côté sombre de marqueur balise bas que la surface de coupe (figure 1). Le bloc est sectionné jusqu'à ce que la couleur foncée AV-marqueur comme un phare est exposée et visible. Trois à quatre sections microns sont coupés de ce niveau qui devrait contenir la plupart des cellules dispersées individuellement à partir du spécimen. Les coupes sont recueillies sur la lame de verre pour la coloration de loin, la coloration immunohistochimique, ou d'autres tests comme indiqué. Les protocoles de ces essais, y compris le type de diapositives à utiliser pour le montage des sections peuvent varier. Généralement pour immunocoloration, des lames recouvertes sont utilisés pour l'empêcher de flotter et de perte de sections de la glisse lors des étapes immunomarquage. Abréviations utilisées (par ordre alphabétique): CISH, chromogène tests d'hybridation in situ; FISH, fluorescent tests d'hybridation in situ; FFPE, fixés au formol et inclus en paraffine; FNA, aspiration à l'aiguille fine; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, liquide cytologie; réaction PCR polymerase chain; Figure 1. La structure du bloc cellulaire préparé par le protocole de Shidham. Figure 2. Le résumé des différentes étapes de préparation du bloc cellulaire spécimen LBC par le protocole de Shidham. Figure 3. Préparation d'AV-marqueur de pelures de banane. Figure 4. Comparaison des blocs de cellules et sections, avec et sans AV-marqueur. Figure 5. Comparaison des cellularité des sections du bloc cellulaire avec et sans AV-marqueur.