Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

Reaktifler hazırlanması BSA (% 0.5) ve 2 mM EDTA içeren PBS ile bir tampon yapın. MACS ayırma kolonları hava kabarcıklarını engellemek için, 2-8 ° C Kullanmadan önce tampon gazlar ve saklanacak. Biz RPMI 1640 orta% 5 fare içeren serum kullanın. Kültür ortamı, bu bileşiklerin hücre stimülasyon özgüllüğü değiştirmek gibi, BSA veya FCS içermemelidir. Fare IL-17 sekresyonu Testi – Miltenyi-Biotec Hücre Zenginleştirme ve Tespit Kiti. IL-17 Yakalama Reaktif, IL-17 Algılama Antikor (biotin), Anti-Biotin-PE ve Anti-PE mikro kiti aşağıdaki bileşenleri içerir. Splenositlerin Uyarıcı Bu protokol unstimulated dalak ve T hücreleri için bir karşı negatif ve pozitif kontrol, huzurunda yapılır. Bu protokol, steril tekniği kullanılarak yürütülmektedir. GentleMACS ™ Dissociator kullanılarak izole edildi fare dalak tek bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücre konsantrasyonu hücre sayımı ile önceden belirlenmiş olmalıdır. Pelet oda sıcaklığında 10 dakika için 200 × g hücreleri. Santrifüj sonrasında, bir pipet kullanarak pelet kapalı supernatant aspirat. Pelet kaybını önlemek için tüp süzün. Şimdi, kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve sonra iyi bir eklemek. ML başına on milyon hücreleri ve santimetrekare başına beş milyon hücre bir konsantrasyon için yeterli orta ekleyin. Yeniden süspanse hücreleri bağışıklık yanıtının teşvik etmek, örnek ionomycin (1 mcg / ml) ve PMA (10 ng / ml) ekleyin ve karışımı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme çözüm. Daha sonra kuyu buna göre etiketlenir. Şimdi, bizim hücreleri 3 saat için 37 ° inkübe olacak ° C uyarılması dönemi başlatmak için herhangi bir karışım. Stimülasyon başlangıcından IL-17 analizi sonucunda 3 saat devam edin, buna göre planlayın. Salgılanması durdurmak için, hücre buz üzerine yerleştirilir ve soğuk tampon yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tarafından uyarılmış hücreleri toplamak. Hücreler daha sonra iyi bir tüpe aktarılır ve ikinci kez yıkanır. Tüm hücreleri toplanır emin olmak için, bir mikroskop altında çanak kontrol etmek için iyi bir fikirdir. Eğer hücreler hala bağlı kalır, soğuk tamponu ile bulaşık durulama kalan hücreleri toplamak. Herhangi bir hücre kümeleri hücre süspansiyonu öncesi ayırma filtreleri kullanarak silinebilir. Yakalama Reaktif Hücreler Etiketleme IL-17 salgılayan hücrelerin% 2'den az bulunması halinde bu testte en iyi şekilde çalışıp çalışmadığını, dikkat etmek çok önemlidir. , IL-17 salgılayan hücreleri konsantrasyonu, buna göre hacimleri ayarla% 2 daha fazla olması bekleniyor. Bu prosedürün potansiyel Bir hatadır Catch Reaktif çapraz kontaminasyon, iki spesifik antikor böylece yanlış pozitif olmayan bir salgılayan T hücre ve tuzakları bir komşu lenfosit salgılanan IL-17 üreten, bağlanır etiketleme sırasında oluşabilir. Bu sorunu aşmak için, IL-17 difüzyon yavaş ve bu çapraz bulaşmayı önlemek için önce soğuk tamponu ile etiketleme ve iş aşağı soğuk hücreler için kritik öneme sahiptir. Hücreleri soğuk tutmak için ek olarak, belirli bir konsantrasyon tutulmalıdır. Etiketleme prosedürü başlatmak için, 15 ml kapaklı tüp içinde on milyon hücreleri kullanır. Kullanılmak üzere yüksek hücre sayıları varsa, sadece buna bağlı tüm birimler büyütmek. Optimal hücre konsantrasyonu elde edildikten sonra, 10 ml soğuk tampon ekleyerek hücreleri yıkayın. Soğutmalı santrifüj (2-8 ° C) 10 dakika için 300 hücreleri × g dönerler. Santrifüj sonra, tamamen bir pipet kullanarak süpernatant aspirat. Bu hücre kaybı ve kesin olmayan birimler yol açacak gibi süpernatant süzün. Soğuk tampon, santrifüj ve aspirasyon 10ml ekleyerek oluşan yıkama adımı yineleyin. Şimdi biz bir pelet istenilen saflık olduğunu, soğuk kültür ortamı 80 mcL hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Etiketlemek için, şimdi 20 mcL Fare IL-17 Catch Reaktif katacak. 5 dakika buz üzerinde hücrelerin inkübe edin. 5 dakika buz üzerinde kuluçka döneminden sonra, tüp kaldırmak ve 37 ° C sıcak bir ortamda 10 ml hücrelerin sulandırmak. Sonra MACSmix Tüp Rotator tüp güvenli ve tüp inkübe 37 ° C altında 45 dakika süreyle sürekli hareket. Sıcaklığının artmasıyla 37 ° C sitokin salgılanması yeniden başlayacaktır. IL-17 Algılama Antikor (Biotin) ve Anti-Biotin-PE Hücreler Etiketleme 37 ° C'de 45 dakika salgılanması süre sonra, buz üzerinde hemen tüp yerleştirin. Bu sitokin salgılanması durur. Burada üzerinde buz üzerinde hücre tutmak için kritik öneme sahiptir.Soğuk tampon Çalışma Catch Reaktif çapraz kontaminasyonu engellemek. 2-8 300xg soğuk tampon ve santrifüj ° C de 10 dakika ile tüp doldurun. Süpernatantı tamamen aspire. Yıkama, bir kez daha adımı yineleyin. Hücre pelletini soğuk tampon 80 mcL yeniden süspanse ve buz üzerinde tüp yerleştirilir. Antikor belirsiz bağlanma önlemek için, 5 dakika buz 10μl FCR Engelleme Reaktif ve inkübe eklenmesi önerilir. Sonra, 10 dakika boyunca buz üzerinde biotin ve inkübe konjuge Fare IL-17 Algılama Antikor (Biotin) 20 mcL ekleyin. Bir kez daha, 2-8 300xg soğuk tampon ve santrifüj 10 ml ekleyerek ° C 10 dakika önce yaptığı gibi hücrelerin yıkayın. Şimdi süpernatant aspirat ve soğuk tampon 80 ul hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Ikincil antikor, Anti-Biotin-PE 20 mcL ekleyin. Hücreler ve sekonder antikor çözüm karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tüp tekrar kuluçkaya yatmaktadır. Bu ikinci inkübasyon tamamlandıktan sonra, 10 ml soğuk tampon ve santrifüj ile hücreleri yıkayın. Pelet şimdi soğuk tampon 500 mcL yeniden süspanse edilebilir. Hücreler daha fazla alt analizi için ayrılacak varsa, bunlar manyetik Anti-PE-mikro etiketli ve MACS Sütunlar ve MACS Ayırıcılar kullanarak elle ya da otomatik ayrılmış olabilir. Şimdi splenositlerin etiketleme ve analiz için hazır hale gelmiş. FACS Analizi Bizim analizi için, flow sitometri ile uyarılır ve unstimulated splenositlerin karşılaştırabilirsiniz. Akım sitometri analizi önce, hücrelerin ölü hücreleri çıkış kapısı propidium iyodür ile 0.5 mg / ml lekeli. MACSQuant ™ Analyzer, her bir örnek için 200.000 hücre yüklü ve şimdi örnekleri göreli antikor reaktivite dağılım araziler bakmaya devam etmektedir. Nadir hücrelerinin analizi için iki önemli hususlar – IL-17 pozitif hücrelerin gibi flow sitometri ile: forward scatter karşı yan scatter plot lenfosit bir kapı ayarı ve ölü hücreleri (propidium iyodür ile boyanmış) ve B-hücrelerinin (belirsiz arka plan boyama yol açabilir) dışarı yolluk algılama hassasiyeti daha da geliştirmek için , CD4-APC T hücreleri ve B hücreleri algılamak için CD45R/B220-PerCP antikor tespit antikor kullanılır. Biz örneklerin ileri ve yan dağılım özelliklerini görmek ve lenfosit nüfus üzerinde bir kapı uygulamak. Lekeli ölü hücreleri ve lekeli B hücreleri (Y ekseni) görmek için ikinci bir kapı yapıldı. Bu hücreler, T hücre analizi hariç tutulur. Bu örnekte, aslında bizim negatif kontrol, biz unstimulated örnekleri çok az sayıda IL-17 salgılayan CD4 pozitif T hücreleri olduğunu görebilirsiniz – yaklaşık% 0.003 (Şekil 4). Uyarılmış T hücre popülasyonu baktığımızda, önemli sayıda CD4 pozitif T hücreleri görebilirsiniz salgılar IL-17 – ayırma önce 0,367% (Şekil 5A) ve MACS Teknoloji (Şekil 5B) ile manyetik ayırma sonra% 60.76.