Обнаружение и выделение жизнеспособных Мышь Ил-17-секретирующих клеток Т

Подготовка реагентов Сделать буфер, содержащий PBS с BSA (0,5%), и 2 мМ ЭДТА. Потому что пузырьки воздуха могут блокировать колонны MACS разделения, буфер должен быть дегазированной и хранить при температуре 2-8 ° С до использования. Мы используем RPMI 1640, содержащей 5% сыворотки мыши. Культуральная среда не должна содержать BSA или ФТС, так как эти соединения будут менять специфику стимуляции клеток. Ил-17 Мышь Секреция Пробирной – обогащение клеточной и обнаружения Kit от Miltenyi-Biotec. Набор содержит следующие компоненты: Ил-17 Поймайте реагентов, Ил-17 обнаружение антител (биотин), Anti-биотин-PE, а также Anti-PE микрошарики. Стимулирование Спленоциты Этот протокол выполняется в присутствии отрицательных и положительных контроля, таких как нестимулированных спленоцитов и контрастирующая для Т-клеток. Этот протокол осуществляется с использованием стерильной техники. Подготовка суспензии отдельных клеток мыши спленоцитов, которые были изолированы с помощью диссоциатор gentleMACS ™. Концентрации клеток должны быть заранее определены с помощью подсчета клеток. Гранул клеток при 200 × г в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугирования супернатант аспирата от гранул с помощью пипетки. Не переливать трубку, чтобы избежать потери гранул. Теперь, ресуспендирования клеток в культуральной среде, а затем добавить в колодец. Добавьте достаточное средство для концентрации в десять миллионов клеток на мл и пять миллионов клеток на квадратный сантиметр. Чтобы стимулировать иммунный ответ в нашем ресуспендировали клетки, мы добавляем иономицина (1 мкг / мл) и PMA (10 нг / мл), образец и перемешать раствор, осторожно пипетирования вверх и вниз. Затем скважин маркированы соответственно. Теперь мы инкубировать наших клетках в течение 3 часов при 37 ° С без перемешивания, чтобы начать стимуляцию периода. Приступить к Ил-17 Анализ 3-х часов от начала стимуляции, так что планируйте соответственно. Чтобы остановить секрецию, клетки помещали на лед, и мы собираем стимулированных клеток, мягко пипетирования вверх и вниз с холодной буфера. Затем клетки передается от скважины до трубки и моются во второй раз. Чтобы убедиться, что все клетки собираются, это хорошая идея, чтобы проверить ваше блюдо под микроскопом. Если клетки по-прежнему остаются прикрепленными, можно собрать оставшиеся клетки путем промывки блюдо с холодной буфера. Любая клетка сгустки в вашей клеточной суспензии можно удалить с помощью предварительного отделения фильтров. Маркировка Клетки с Поймать реагент Крайне важно отметить, что в этом анализе работ оптимально, если менее 2% от Ил-17-секретирующих клеток. Если концентрация ИЛ-17 клетки, секретирующие как ожидается, будет выше 2% корректировать объемы соответственно. Одним из потенциальных ловушка этой процедуры является перекрестное загрязнение Поймать реагентов, которые могут возникнуть в процессе маркировки, когда би-специфическое антитело связывается с не-секретирующие Т-клеток и ловушки Ил-17 выделяется из соседних лимфоцитов, тем самым генерации ложных срабатываний. Для того чтобы обойти эту проблему, очень важно, чтобы охладить ячейки вниз до маркировки и работа с холодным буфером, чтобы замедлить распространение Ил-17 и избежать перекрестного загрязнения. В дополнение к поддержанию клетки холодно, они должны храниться при определенной концентрации. Чтобы начать процедуру маркировки, мы используем десять миллионов клеток в 15 мл закрывающуюся пробирку. Если высшие номера сотовых должны быть использованы, просто масштаб копии всех томов соответственно. После оптимальной концентрации клетка была получена, мыть клетки, добавляя 10 мл холодного буфера. Спином вниз клетки при 300 × г в течение 10 минут в охлажденном центрифуги (2-8 ° С). После центрифугирования супернатант аспирата полностью с помощью пипетки. Не переливать супернатант так как это приведет к потере клетки и неточные томов. Повторите промывание шаг, который заключается в добавлении 10 мл холодного буфера, центрифугирование, и стремление. Теперь, когда мы гранул желаемой чистоты, ресуспендирования клеток в 80 мкл холодной питательной среды. Чтобы пометить их, мы добавим 20 мкл Мышь Ил-17 Поймайте реагентов. Инкубируйте клетки в течение 5 минут на льду. После 5 минут инкубационного периода на льду, снимите трубку и разбавленных клеток в 10 мл 37 ° С теплой среде. Затем зафиксируйте трубы на трубы Rotator MACSmix и инкубировать трубке при 37 ° С в течение 45 мин при непрерывном движении. Повышение температуры до 37 ° С, будет возобновление секреции цитокинов. Маркировка Клетки с Ил-17 обнаружение антител (биотин) и Анти-биотин-PE После 45-минутного периода секреции при 37 ° С, положите трубку сразу же на льду. Это остановит секреции цитокинов. С этого момента очень важно сохранить клетки на льду.Работа с холодным буфер позволит избежать перекрестного загрязнения Поймать реагентов. Заполнение трубы с холодной буфера и центрифуге при 300xg при температуре 2-8 ° С в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант полностью. Повторите мыть шаг еще раз. Осадок клеток ресуспендируют в 80 мкл холодного буфера и трубки помещают на лед. Во избежание неспецифического связывания антител, мы рекомендуем добавлением 10 мкл FcR Blocking Reagent и инкубировать на льду в течение 5 мин. Затем мы добавляем 20 мкл Мышь Ил-17 обнаружение антител (биотин), что сопряжено с биотином и инкубировать в течение 10 минут на льду. Еще раз, мыть клетки, как мы делали раньше, добавляя 10 мл холодного буфера и центрифуге при 300xg при температуре 2-8 ° С в течение 10 мин. Теперь аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 80 мкл холодного буфера. Добавьте 20 мкл наши вторичные антитела, анти-биотин-PE. Смешайте клетки и вторичные антитела решение, и снова инкубируют трубку в течение 10 минут на льду. После этого второй инкубации завершения мытья клеток с 10 мл холодного буфера и центрифуги. Гранулы теперь можно ресуспендировали в 500 мкл холодного буфера. Если клетки должны быть отделены для дальнейшего анализа вниз по течению, они могут быть магнитно помечены Anti-PE-микрошарики и отделена вручную или с использованием автоматизированных MACS MACS Колонны и сепараторы. Мы уже завершили маркировки спленоцитов и готовы для анализа. FACS анализ Для нашего анализа мы будем сравнивать стимулируется и нестимулированных спленоцитов с помощью проточной цитометрии. Перед проточной цитометрии, клетки окрашивали пропидий йодида на уровне 0,5 мкг / мл до ворот из мертвых клеток. MACSQuant Analyzer ™ была загружена 200000 клеток для каждого образца, и теперь мы будем смотреть на графиков разброса относительной реакционной антител в образцах. Два важных соображения для анализа редких клеток – типа Ил-17-положительных клеток – с помощью проточной цитометрии являются: установка ворот на лимфоцитов вперед по сравнению с разбросом сюжет стороны разброса стробирования и из мертвых клеток (окрашенных йодистым пропидий) и В-клеток (которые могут вызвать неспецифические окрашивания фона) для дальнейшего повышения чувствительности обнаружения Мы использовали CD4-APC антител для обнаружения Т-клеток и антител CD45R/B220-PerCP для выявления В-клеток. Мы видим, вперед и стороной разброс свойств образцов и применить ворота на популяции лимфоцитов. Вторые ворота была применена, чтобы увидеть витражи мертвых клеток и окрашенных клеток B (Y ось). Эти клетки, исключаются из анализа Т клетки. В этом примере, который по сути наш отрицательный контроль, мы видим, что Есть очень мало Ил-17 CD4 секретирующих положительные Т-клетки в нестимулированных образцов – около 0,003% (рис. 4). Глядя на стимулировали население Т-клеток, мы можем видеть значительное число CD4 + Т-клеток, которые секретируют ИЛ-17 – около 0,367% (рис. 5А) до разделения и 60,76% после магнитной сепарации с MACS Technology (рис. 5б).