Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

Preparar os Reagentes Faça um buffer contendo PBS com BSA (0,5%), e 2 mM EDTA. Porque as bolhas de ar podem bloquear colunas de separação MACS, o buffer deve ser desgaseificado e armazenado a 2-8 ° C antes do uso. Usamos meio RPMI 1640 contendo soro do mouse 5%. O meio de cultura não deve conter BSA ou FCS, uma vez que estes compostos irão alterar a especificidade de estimulação celular. A IL-17 Rato Ensaio Secreção – Enriquecimento Celular e Kit de Detecção da Miltenyi Biotec-. O kit contém os seguintes componentes: a IL-17 Reagente Catch, a IL-17 anticorpo de detecção (Biotina), o Anti-Biotina-PE, e as microesferas de Anti-PE. Estimulando a esplenócitos Este protocolo é realizado na presença de um controle negativo e positivo, como esplenócitos unstimulated e um contracoloração para células T. Este protocolo é realizado utilizando técnica estéril. Preparar uma suspensão única célula de esplenócitos de camundongo que foram isolados usando o gentleMACS Dissociator ™. A concentração de células deve ser determinada através de contagem das células. Agregar as células em 200 × g por 10 minutos em temperatura ambiente. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante fora do pellet utilizando uma pipeta. Não decantar o tubo para evitar a perda de sedimento. Agora, voltar a suspender as células em meio de cultura e, em seguida, adicionar a um poço. Adicionar média suficiente para uma concentração de 10 milhões de células por mL e cinco milhões de células por centímetro quadrado. Para estimular uma resposta imune em nossas células ressuspenso, acrescentamos ionomicina (1 mg / mL) e PMA (10 ng / mL) para a amostra e misture delicadamente a solução pipetando para cima e para baixo. Em seguida, os poços são rotulados em conformidade. Agora, vamos incubar nossas células durante 3 horas a 37 ° C sem mistura para iniciar o período de estimulação. Proceder à análise de IL-17 três horas desde o início da estimulação, de modo plano nesse sentido. Para interromper a secreção, as células são colocadas em gelo e coletamos as células estimuladas por delicadamente pipetando para cima e para baixo com tampão de frio. Células são então transferidos do bem a um tubo e são lavados uma segunda vez. Para garantir que todas as células são coletadas, é uma boa idéia para verificar o seu prato sob um microscópio. Se as células ainda permanecem conectados, você pode coletar as células restantes lavando o prato com tampão de frio. Qualquer aglomerados de células na sua suspensão de células pode ser removido usando os filtros de pré-separação. Rotulagem as células com reagente Trave É fundamental notar, que este teste funciona perfeitamente se inferior a 2% de IL-17 são células secretoras de presente. Se a concentração de IL-17 células secretoras deverá ser superior a 2% ajustar volumes em conformidade. Uma armadilha potencial deste procedimento é a contaminação cruzada do Reagente Catch, que pode ocorrer durante a rotulagem quando o anticorpo bi-específico liga-se a uma célula T não secretores e armadilhas IL-17 secretada a partir de um linfócito vizinhos, gerando falsos positivos. A fim de contornar este problema, é fundamental para as células esfriar antes de rotulagem e trabalhar com buffer de frio para lenta difusão de IL-17 e evitar essa contaminação cruzada. Além de manter as células frio, eles devem ser mantidos a uma concentração definida. Para iniciar o procedimento de rotulagem, usamos 10 milhões de células em um tubo de 15 ml que pode ser fechado. Se os números mais altos de células têm de ser utilizados, simplesmente escala de todos os volumes em conformidade. Uma vez que a concentração celular ideal foi obtida, lave as células, adicionando 10 ml de tampão frio. Girar as células em 300 × g por 10 minutos em centrífuga refrigerada (2-8 ° C). Após centrifugação, aspirar o sobrenadante completamente usando uma pipeta. Não decantar o sobrenadante, pois isso levará a perda de células e volumes imprecisa. Repita o passo de lavagem, que consiste na adição de 10ml de solução de frio, a centrifugação, e aspiração. Agora que temos uma pelota de pureza desejado, ressuspender as células em 80 mL de meio de cultura frio. Para classificá-los, vamos agora adicionar 20 mL de Reagente rato Pegue IL-17. Incubar as células por 5 minutos no gelo. Após o período de incubação 5 minutos no gelo, retire o tubo e diluir as células em 10 ml de 37 C ° média morna. Em seguida, prenda o tubo na Rotator Tubo MACSmix e incubar os tubos a 37 ° C por 45 min em movimento contínuo. Aumentando a temperatura para 37 ° C vai re-iniciar a secreção de citocinas. Rotulagem as células com IL-17 anticorpo de detecção (Biotina) e Anti-Biotina-PE Após o período de secreção de 45 minutos a 37 ° C, colocar o tubo imediatamente em gelo. Isto irá parar a secreção de citocinas. A partir daqui é fundamental para manter as células no gelo.Trabalhando com tampão frio vai evitar a contaminação cruzada do Reagente Catch. Encha o tubo com tampão de frio e centrifugar a 300xg a 2-8 ° C por 10 min. Aspirar o sobrenadante completamente. Repita o passo lavar mais uma vez. O pellet celular é ressuspenso em 80 mL de tampão frio eo tubo é colocado sobre o gelo. Para evitar a ligação inespecífica do anticorpo, recomendamos a adição de 10μl Reagente FcR Bloqueio e incubar no gelo por 5 min. Então adicionar 20 mL de anticorpo de detecção do rato IL-17 (Biotina), que é conjugado a biotina e incubar por 10 minutos no gelo. Mais uma vez, lave as células como fizemos antes, adicionando 10 mL de tampão frio e centrifugar a 300xg a 2-8 ° C por 10 min. Agora aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 80 mL de tampão frio. Adicionar 20 mL de nosso anticorpo secundário, Anti-Biotina-PE. Misture as células e solução de anticorpo secundário, e novamente incubar os tubos durante 10 minutos no gelo. Uma vez que esta segunda incubação é completa, lavar as células com 10 mL de tampão fria e centrifugação. O pellet pode agora ser ressuspendida em 500 mL de tampão frio. Se as células têm que ser separados para análise a jusante, podem ser rotulados com magneticamente Anti-PE-micro e separada manualmente ou automatizado usando MACS Colunas e Separadores de MACS. Completamos agora a rotulagem dos esplenócitos e estão prontos para análise. Análise FACS Para nossa análise, vamos comparar os esplenócitos estimulados e desestimulados por citometria de fluxo. Antes da análise de citometria de fluxo, as células são coradas com iodeto de propídio a 0,5 mcg / mL para deixar de fora as células mortas. O Analyzer ™ MACSQuant estava carregado com 200.000 células para cada amostra e agora estamos indo olhar os gráficos de dispersão de reatividade de anticorpos relativa nas amostras. Duas considerações importantes para a análise de células raras – como a IL-17 células positivas – por citometria de fluxo são: definição de um portão em linfócitos na dispersão frontal versus gráfico de dispersão lado gating e as células mortas (coradas com iodeto de propídio) e células-B (que pode causar coloração de fundo inespecífica) para aumentar ainda mais a sensibilidade de detecção Usamos CD4-APC anticorpos para detectar células T e os anticorpos CD45R/B220-PerCP de detectar as células B. Nós vemos as propriedades de dispersão para frente e laterais das amostras e aplicar um portão sobre a população de linfócitos. Um segundo portão foi aplicada a ver as células mortas e as células manchadas manchado B (eixo Y). Estas células são excluídos da análise de células T. Neste exemplo, que é essencialmente nosso controle negativo, podemos ver que há muito poucos IL-17 CD4 T secretoras de células positivas em amostras não estimuladas – cerca de 0,003% (Figura 4). Olhando para a população de células T estimuladas, podemos ver um grande número de células CD4 positivas T que secretam IL-17 – cerca de 0,367% (Figura 5A) antes da separação e 60,76% após a separação magnética com MACS Tecnologia (Figura 5B).