가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

시약 준비 BSA (0.5 %), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS를 포함하는 버퍼를 확인합니다. 공기 거품이 맥 분리 열을 차단할 수 있기 때문에, 버퍼는 2-8 ° C에서 사용하기 전에 degassed하고 저장해야합니다. 우리는 5 % 마우스 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용합니다. 문화 매체는 이러한 화합물은 세포 자극의 특이성을 변경하므로, BSA 또는 FCS를 포함해서는 안됩니다. 마우스 IL – 17 분비 분석 – Miltenyi Biotec에서 셀 – 농축 및 탐지 키트. IL – 17 캐치 시약, IL – 17 탐지 항체 (비오틴), 안티 – 비오틴 – PE 및 안티 체육 MicroBeads : 키트는 다음과 같은 구성 요소가 포함되어 있습니다. Splenocytes을 자극 이 프로토콜은 이러한 unstimulated splenocytes 및 T 세포에 대한 counterstain로 부정과 긍정적인 컨트롤의 존재에서 수행됩니다. 이 프로토콜은 살균 기술을 사용하여 수행됩니다. gentleMACS ™의 Dissociator를 사용하여 격리되었다 마우스 splenocytes의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포의 농도는 세포 계수를 통해 미리 정해진해야합니다. 실온에서 10 분간 200 × g에서 펠렛은 세포. 원심 분리 다음, 피펫을 사용하여 펠렛에서 뜨는을 대기음. 펠렛의 손실을 피하기 위해 튜브를 가만히 따르다하지 마십시오. 이제 문화 매체에있는 세포를 resuspend 다음 잘 추가할 수 있습니다. ML 당 천만 세포 cm2 당 오백만 세포의 농도에 대한 충분한 매체를 추가합니다. 우리 resuspended 세포에 면역 반응을 촉진하기 위해, 우리는 샘플을 ionomycin (1 μg / ML)와 PMA (10 NG / ML) 추가하고 부드럽게 최대 pipetting 아래로 혼합 솔루션을. 그러면 우물이 적절하게 표시됩니다. 이제, 우리는 37 3 시간 동안 우리의 세포를 품어됩니다 ° C 자극 기간을 시작없이 믹싱과 함께. 자극의 시작에서 IL – 17 분석 3 시간 진행되므로 적절하게 계획이다. 분비를 중지하려면, 전지가 얼음에 위치하고 부드럽게 감기 버퍼와 아래 pipetting하여 자극을 세포를 수집하고 있습니다. 세포는 다음 우물에서 튜브로 전송하고 두 번째 시간을 씻어 있습니다. 모든 세포가 수집되는 것을 보장하기 위해, 그것은 현미경 아래에 접시를 확인하는 것이 좋습니다. 세포가 여전히 남아 첨부하면 감기 버퍼와 접시를 rinsing하여 남아있는 세포를 수집할 수 있습니다. 당신의 세포 현탁액의 모든 세포 대단히 짧은 시간은 미리 분리 필터를 사용하여 제거할 수 있습니다. 캐치 시약으로 세포를 라벨링 그것은 IL – 17 – secreting 세포의 2 % 미만이있는 경우에는이 분석은 최적의 작동, 참고 파라마운트입니다. IL – 17 secreting 세포의 농도가 적절하게 볼륨을 조절할 이상 2퍼센트 것으로 예상하는 경우. 이 절차의 함정 하나 가능성 BI 특정 항체가되므로 잘못된 반응을 생성, 비 secreting의 T 세포와 인접 림프구에서 분비 트랩 IL – 17에 바인딩 할 때 레이블링하는 동안 발생할 수있는 캐치 시약의 교차 오염이다. 이 문제를 회피하기 위해서는 IL – 17의 보급을 저하이 교차 오염을 피하기 위해 아래 사전 추위 버퍼와 라벨 부착 및 작동하도록 냉각 세포에 중요합니다. 세포 차가운 유지 이외에, 그들은 정의 농도에 보관해야합니다. 라벨 절차를 시작하기 위해, 우리는 15 ML closable 튜브 천만 세포를 사용합니다. 높은 세포 숫자가 사용할 수있다면, 간단하게 따라 모든 볼륨을 최대 규모. 최적의 세포 농도를 얻을되면 추위 버퍼 10 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오. 냉장 원심 분리기 10 분 (2-8 ° C) 300에서 전지 × g를 스핀 다운. 원심 분리에 따라 완전히 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 대기음. 이 세포 손실 및 이란게 부정 확한 볼륨을 이끌로 뜨는을 가만히 따르다하지 마십시오. 감기 버퍼, 원심 분리하고, 열망의 10ml를 추가로 구성되어 세척 단계를 반복합니다. 이제 원하는 순도의 펠렛을 가지고, 차가운 문화 매체 80 μL의 세포를 resuspend. 그들을 분류하기 위해, 우리는 이제 마우스 IL – 17 캐치 시약 20 μL를 추가합니다. 얼음 5 분 동안 세포를 품어. 얼음에 5 분 잠복기 후, 튜브를 제거하고 37 ° C 따뜻한 매체 10 ML에있는 세포를 희석. 다음 MACSmix 튜브의 회전에 튜브를 확보하고 37 튜브를 품어 ° C를 지속적으로 움직임에 따라 45 분. 37 온도를 증가하는 것은 ° C는 시토킨 분비를 다시 시작합니다. IL – 17 탐지 항체 (비오틴) 및 안티 – 비오틴 – PE와 세포를 라벨링 37 ° C에서 45 분 분비 기간 후, 얼음에 즉시 튜브를 놓으십시오. 이것은 시토킨 분비를 중지합니다. 여기에서 그것에 얼음에 세포를 유지하는 것이 중요합니다.감기 버퍼로 작업하면 캐치 시약의 교차 오염을 방지합니다. 2-8에서 300xg에서 추위 버퍼와 원심 분리기 ° 10 분 C로 튜브를 입력합니다. 완전히 뜨는을 대기음. 세척이 한 번 더 단계를 반복합니다. 세포 펠렛은 추위 버퍼의 80 μL에 resuspended이며, 튜브는 얼음에 위치합니다. 항체의 unspecific 바인딩을 방지하기 위해, 우리는 5 분 얼음에 10μl의 FcR 차단 시약과 부화를 추가하는 것이 좋습니다. 그럼 우리가 얼음에 10 분간 비오틴과 부화 복합이다 마우스 IL – 17 탐지 항체 (비오틴) 20 μL를 추가합니다. 다시 한번, 우리는 2-8에서 300xg에서 추위 버퍼와 원심 분리기 10 ML 추가 ° C, 10 분에 의해 전에했던 것처럼 세포를 씻으십시오. 지금 뜨는을 대기음 차가운 버퍼 80 μl의 세포 펠렛을 resuspend. 우리 이차 항체, 안티 – 비오틴 – PE 20 μL를 추가합니다. 세포와 보조 항체 솔루션을 섞어서 다시 얼음에 10 분 동안 튜브를 품어. 이 두 번째 배양이 완료되면, 10 ML 감기 버퍼와 원심 분리기로 세포를 씻어. 펠렛은 이제 추운 버퍼 500 μL에 resuspended 수 있습니다. 세포가 더 하류 분석을 위해 분리 수있다면, 그들은 자기 (磁 气) 안티 – PE – MicroBeads으로 표시하고 Mac에서 열 및 Mac에서 구분 기호를 사용하여 수동 또는 자동 분리 수 있습니다. 우리는 이제 splenocytes의 라벨링을 완료 및 분석을위한 준비가되어있다. 외과 분석 우리의 분석을 위해, 우리는 유동세포계측법에 의해 자극과 unstimulated splenocytes을 비교합니다. 흐름 cytometric 분석하기 전에 전지가 죽은 세포 밖으로 게이트 0.5 μg / ML에서 propidium 요오드화물 물들일 수 있습니다. MACSQuant ™ 분석기는 각 샘플에 대한 200,000 개 셀 탑재되어 이제 샘플의 상대적인 항체 반응의 스캐터 플롯을 볼 줄 수 있습니다. 희귀 세포의 분석을 위해 두 가지 중요한 고려 사항 – IL – 17 양성 세포와 같은 – 유동세포계측법에 있습니다 : 앞으로 분산 비교 측면 스캐터 플롯에 lymphocytes에 게이트를 설정 그리고 죽은 세포 (propidium 요오드화물의 물들일)와 B – 세포 (unspecific 배경 얼룩의 원인이 될 수있는)가 게이팅 추가 검출의 감도를 향상시키기 위해 우리는 T 세포와 B 세포를 감지하는 CD45R/B220-PerCP 항체를 감지하는 CD4 – APC 항체를 사용했습니다. 우리는 샘플의 전방 및 측면 산란 특성을 확인하고 림프구 인구에 게이트를 적용합니다. 두 번째 게이트는 스테인드 죽은 세포와 스테인드 B 세포 (Y 축)를 참조하기 위해 적용되었습니다. 이러한 세포는 T 세포 분석에서 제외됩니다. 이 예제에서, 어떤은 본질적으로 우리의 부정적인 제어이며, 우리는 unstimulated 샘플에서 거의 IL – 17 secreting의 CD4 양성 T 세포가있다는 것을 알 수 있습니다 – 약 0.003 % (그림 4). 자극 T 세포 인구를 살펴보면, 우리는 CD4의 상당수 긍정적인 T 세포를 볼 수 분비 IL – 17 – 분리하기 전에 0.367 % 정도 (그림 5A)와 Mac에서 기술 (그림 5B)와 자성 분리 후 60.76 %.