Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

Preparazione dei reagenti Fai un buffer contenente PBS con BSA (0,5%), e 2 mM EDTA. Perché le bolle d'aria in grado di bloccare colonne di separazione MACS, il buffer deve essere degassata e conservato a 2-8 ° C prima dell'uso. Noi usiamo RPMI 1640 medium contenente siero del mouse 5%. Il terreno di coltura non deve contenere BSA o FCS, in quanto questi composti alterano la specificità della stimolazione delle cellule. L'IL-17 mouse Assay secrezione – Arricchimento delle cellule e Detection Kit-da Miltenyi Biotec. Il kit contiene i seguenti componenti: l'IL-17 reagente di cattura, la IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina), l'anti-biotina-PE, e l'Anti-PE microsfere. Stimolare il splenociti Questo protocollo è eseguita in presenza di un controllo negativo e positivo, come splenociti non stimolate e di contrasto per le cellule T. Questo protocollo è eseguita con tecnica sterile. Preparare una sospensione singola cella di splenociti mouse che sono stati isolati utilizzando il dissociatore gentleMACS ™. La concentrazione di cellule devono essere predeterminati attraverso il conteggio delle cellule. Agglomerare le cellule a 200 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante fuori il pellet con una pipetta. Non decantare il tubo per evitare la perdita del pellet. Ora, risospendere le cellule nel mezzo di coltura e quindi aggiungere ad un pozzo. Aggiungere mezzo sufficiente per una concentrazione di dieci milioni di cellule per mL e cinque milioni di cellule per centimetro quadrato. Per stimolare una risposta immunitaria nelle nostre cellule risospese, aggiungiamo ionomicina (1 mg / mL) e PMA (10 ng / ml) al campione e mescolare la soluzione pipettando gentilmente su e giù. Poi i pozzi sono debitamente etichettati. Ora, noi incubare le nostre cellule per 3 ore a 37 ° C senza miscelazione per iniziare il periodo di stimolazione. Procedere alla IL-17 analisi 3 ore dalla comparsa dei stimolazione, in modo da pianificare di conseguenza. Per interrompere la secrezione, le cellule sono immessi sul ghiaccio e raccogliamo le cellule stimolate pipettando gentilmente su e giù con il tampone a freddo. Le cellule sono poi trasferiti dal bene a un tubo e vengono lavati una seconda volta. Per garantire che tutte le cellule vengono raccolte, è una buona idea controllare il vostro piatto al microscopio. Se le cellule sono ancora attaccato, è possibile raccogliere le cellule rimanenti risciacquando il piatto con il tampone a freddo. Eventuali grumi di cellule in sospensione cellulare può essere rimosso utilizzando il pre-separazione filtri. Etichettare le cellule con reagente Cattura E 'fondamentale notare che questo test funziona in modo ottimale se meno del 2% di IL-17-secernenti cellule sono presenti. Se la concentrazione di IL-17 le cellule secernenti dovrebbe essere superiore al 2% regolare i volumi di conseguenza. Un potenziale problema di questa procedura è la contaminazione incrociata dei reagenti Catch, che può verificarsi durante l'etichettatura quando il bi-specifico anticorpo si lega ad un non-secernenti delle cellule T e le trappole IL-17 secreta da un linfocita vicini, generando falsi positivi. Per aggirare questo problema, è fondamentale per le cellule raffreddare prima dell'etichettatura e lavorare con tampone a freddo per rallentare la diffusione di IL-17 e di evitare la contaminazione incrociata. Oltre a mantenere le celle frigorifere, devono essere mantenuti ad una concentrazione definita. Per iniziare la procedura di etichettatura, si usa 10.000.000 cellule in una provetta da 15 ml richiudibili. Se il numero di cellule superiore devono essere utilizzati, semplicemente scala di tutti i volumi di conseguenza. Una volta che la concentrazione cellulare ottimale è stata ottenuta, lavare le cellule con l'aggiunta di 10 ml di tampone a freddo. Spin giù le cellule a 300 × g per 10 minuti in una centrifuga refrigerata (2-8 ° C). Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante completamente con una pipetta. Non decantare il sopranatante come questo porterà alla perdita di cellule e volumi impreciso. Ripetere la fase di lavaggio, che consiste di aggiungere 10 ml di tampone a freddo, centrifugazione, e aspirazione. Ora che abbiamo un pellet di purezza desiderato, risospendere le cellule in 80 ml di terreno di coltura a freddo. Etichettarli, noi ora aggiungere 20 ml di mouse IL-17 reagente Catch. Incubare le cellule per 5 minuti in ghiaccio. Dopo il periodo di incubazione di 5 minuti sul ghiaccio, rimuovere il tubo e diluire le cellule in 10 ml di 37 ° C di media caldi. Poi fissare il tubo sul Tubo Rotator MACSmix e incubare il tubo a 37 ° C per 45 minuti sotto continuo movimento. L'aumento della temperatura a 37 ° C ripartirà secrezione di citochine. Etichettare le cellule con IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina) e anti-biotina-PE Dopo il periodo di secrezione 45 minuti a 37 ° C, mettere il tubo immediatamente in ghiaccio. Questo fermerà la secrezione di citochine. Da qui in poi è fondamentale per mantenere le cellule in ghiaccio.Lavorare con tampone freddo evitare la contaminazione crociata dei reagenti Catch. Riempire il tubo con tampone a freddo e centrifugare a 300xg a 2-8 ° C per 10 min. Aspirare il surnatante completamente. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. Il pellet cellulare è risospeso in 80 ml di tampone a freddo e il tubo è posto su ghiaccio. Per evitare il legame non specifico degli anticorpi, si consiglia l'aggiunta di reagente FCR 10μl di blocco e incubare in ghiaccio per 5 min. Poi si aggiungono 20 l di mouse IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina) che è coniugato con biotina e incubare per 10 minuti in ghiaccio. Ancora una volta, lavare le cellule come abbiamo fatto prima con l'aggiunta di 10 mL di tampone a freddo e centrifugare a 300xg a 2-8 ° C per 10 min. Ora aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 80 ml di tampone a freddo. Aggiungere 20 ml di nostro anticorpo secondario, anti-biotina-PE. Mescolare le cellule e la soluzione di anticorpo secondario, incubare e di nuovo il tubo per 10 minuti in ghiaccio. Una volta che questa seconda incubazione è completa, lavare le cellule con 10 mL di tampone fredda e centrifuga. Il pellet può essere risospeso in 500 ml di tampone a freddo. Se le cellule devono essere separati per ulteriori analisi a valle, possono essere magneticamente etichettati con Anti-PE-microsfere e separati manualmente o automatizzati con colonne MACS e separatori MACS. Ora abbiamo completato l'etichettatura del splenociti e sono pronti per l'analisi. FACS analisi Per la nostra analisi, metteremo a confronto i splenociti stimolati e non stimolate mediante citometria a flusso. Prima di citometria a flusso, le cellule sono colorate con ioduro di propidio a 0,5 mg / ml per escludere le cellule morte. L'analizzatore MACSQuant ™ è stato caricato con 200.000 cellule per ogni campione e che ora stanno andando a guardare le trame dispersione di reattività anticorpale relativa nei campioni. Due considerazioni importanti per l'analisi di cellule rare – come IL-17 cellule positive – mediante citometria di flusso sono: impostazione di un cancello sulla linfociti nel scatter in avanti rispetto a scatter plot lato gating e fuori le cellule morte (colorate con ioduro di propidio) e B-cellule (che possono provocare colorazione aspecifica di fondo) per migliorare ulteriormente la sensibilità di rilevazione Abbiamo usato CD4-APC anticorpi per rilevare le cellule T e l'anticorpo CD45R/B220-PerCP per rilevare le cellule B. Vediamo le proprietà scatter in avanti e laterale dei campioni e applicare un gate sulla popolazione linfocitaria. Una seconda porta è stata applicata per vedere le cellule colorate le cellule morte e B colorate (asse Y). Queste cellule sono esclusi dall'analisi delle cellule T. In questo esempio, che è essenzialmente negativo del nostro controllo, possiamo vedere che ci sono pochissimi IL-17 CD4 cellule che secernono positivo T nei campioni non stimolata – circa il 0,003% (Figura 4). Guardando alla popolazione di cellule T stimolate, possiamo vedere un numero consistente di cellule T CD4 positive che secernono IL-17 – circa 0,367% (Figura 5A) prima della separazione e 60,76% dopo la separazione magnetica con MACS Technology (Figura 5B).