Nas células eucarióticas, a replicação do DNA é altamente conservada e fortemente regulada. Múltiplos cromossomas lineares devem ser duplicados com alta fidelidade antes da divisão celular, por isso existem muitas proteínas que cumprem funções especializadas no processo de replicação. A replicação ocorre em três fases: iniciação, alongamento e término, e termina com dois conjuntos completos de cromossomas no núcleo.
A replicação eucariótica segue muitos dos mesmos princípios da replicação do DNA procariótico, mas como o genoma é muito maior e os cromossomas são lineares e não circulares, o processo requer mais proteínas e tem algumas diferenças fundamentais. A replicação ocorre simultaneamente em múltiplas origens de replicação ao longo de cada cromossoma. As proteínas iniciadoras reconhecem e ligam-se à origem, recrutando helicase para desenrolar a dupla hélice de DNA. Em cada ponto de origem, dois garfos de replicação são formados. A primase adiciona então primers de RNA curtos às cadeias simples de DNA, que servem como ponto de partida para a DNA polimerase se ligar e começar a copiar a sequência. O DNA só pode ser sintetizado na direção de 5’ a 3’, pelo que a replicação de ambas as cadeias de um único garfo de replicação prossegue em duas direções diferentes. A cadeia contínua é sintetizada continuamente, enquanto a cadeia descontínua é sintetizada em curtas porções de 100-200 pares de bases de comprimento, chamados fragmentos de Okazaki. Assim que a maior parte da replicação estiver completa, enzimas RNase removem os primers de RNA e a DNA ligase junta quaisquer lacunas na nova cadeia.
A carga do trabalho de copiar DNA em eucariotas é dividida entre vários tipos diferentes de enzimas de polimerase de DNA. As principais famílias de DNA polimerases em todos os organismos são categorizadas pela similaridade das suas estruturas proteicas e sequências de aminoácidos. As primeiras famílias a serem descobertas foram denominadas A, B, C e X, com as famílias Y e D identificadas posteriormente. As polimerases da família B em eucariotas incluem Pol α, que também funciona como primase no garfo de replicação, e Pol δ e ε, as enzimas que fazem a maior parte do trabalho de replicação de DNA nas cadeias contínua e descontínua do molde, respectivamente. Outras DNA polimerases são responsáveis por tarefas como reparar danos no DNA, copiar DNA mitocondrial e plastídeo, e preencher lacunas na sequência de DNA na cadeia descontínua após remoção dos primers de RNA.
Como os cromossomas eucarióticos são lineares, eles são susceptíveis à degradação nas extremidades. Para proteger informações genéticas importantes contra danos, as extremidades dos cromossomas contêm muitas repetições não codificadas de DNA rico em G altamente conservado: os telómeros. Uma pequena saliência de 3’ de cadeia simples em cada extremidade do cromossoma interage com proteínas especializadas, que estabilizam o cromossoma dentro do núcleo. Devido à forma como a cadeia descontínua é sintetizada, uma pequena quantidade de DNA telomérico não pode ser replicada com cada divisão celular. Como resultado, os telómeros gradualmente ficam mais curtos ao longo de muitos ciclos celulares e podem ser usados como um marcador de envelhecimento celular. Certas populações de células, como células germinativas e células estaminais, expressam telomerase, uma enzima que alonga os telómeros, permitindo que a célula se submeta a mais ciclos celulares antes de os telómeros encurtarem.
