SDD-AGE é uma técnica útil para a detecção e caracterização de amilóide como polímeros nas células. Aqui nós demonstramos uma adaptação que torna esta técnica passível de aplicações em larga escala.
Agregação amilóide está associada com patologias diversas proteínas misfolding e subjaz as propriedades de príons infecciosos, que são auto-conformationally templating proteínas que são pensados para ter papéis benéficos em organismos inferiores. Amilóides foram extremamente difíceis de estudar devido à sua insolubilidade e heterogeneidade estrutural. No entanto, a resolução de polímeros amilóide com base no tamanho e insolubilidade detergente tem sido possível graças ao Semi-desnaturação Detergente-Eletroforese em Gel de Agarose (SDD AGE). Esta técnica é encontrar amplo uso para a detecção e caracterização de variantes amilóide conformacional. Aqui, nós demonstramos uma adaptação dessa técnica que facilita seu uso em aplicações em larga escala, tais como telas para prions romance e outras proteínas amiloidogênicas. O método SDD-AGE novos usos de transferência capilar para maior confiabilidade e facilidade de uso, e permite que qualquer gel dimensionados para ser acomodados. Assim, um grande número de amostras, preparadas a partir de células ou proteínas purificadas, podem ser processadas simultaneamente para a presença de SDS-conformistas de proteínas insolúveis marcados.
SDD-AGE foi primeiramente relatada por Kryndushkin et al. 1, para estudar SDS-resistentes complexos do [PSI +] prion em levedura, e desde então tem encontrado uso generalizado estudar tanto prion e príon não-agregados 2-9. No entanto, a transferência das proteínas para uma membrana de eletroforese seguinte em um gel de agarose é problemático, e pode resultar em uma imagem distorcida blot 5. Além disso, a técnica submersa eletrobloting mais comumente utilizado apresenta limitações práticas para o tamanho do gel e, assim, o número de amostras que podem ser processados. Temos abordado estes problemas através do emprego de transferência capilar para baixo 10, um procedimento simples, que utiliza uma pilha de papéis secos blotting para transferir proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose. Transferência capilar evita a distorção e permite géis grande para ser processado facilmente. Há algumas coisas a considerar antes de usar SDD AGE. Para amostras de crude (por exemplo, lisados), imunodetecção de proteínas específicas é necessária. SDD-AGE não totalmente desnaturar a complexos de proteínas de interesse, de modo a proteína (s) a ser detectado deve ostentar uma etiqueta de epítopo fora da região amiloidogênicas. Lisados geralmente podem ser preparados como se fossem para um normal SDS-PAGE, com duas diferenças importantes. Em primeiro lugar, o cuidado maior deve ser tomado para evitar a degradação por proteólise. As condições de desnaturação parcialmente usados aqui não são suficientes para inativar proteases, e também pode fazer proteínas-alvo mais suscetível à proteólise. Use um coquetel inibidor de protease total em pelo menos duas vezes a concentração recomendada. Segundo, o aquecimento das amostras deve ser evitado. Se um controle de monômero de todos os negativos é desejada, por exemplo, para confirmar que de alto peso molecular de espécies não são devido a modificações covalentes, a incubação de 10 minutos a 95 ° C pode ser usada, que vai restaurar a maioria dos amilóides à proteína monomérica.
Agradecemos a Simon Alberti para obter ajuda com o desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi suportado por uma concessão do National Institutes of Health (GM25874), um Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (para SL), e da National Science Foundation bolsa de formação predoctoral (para RH).
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
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zymolyase 100T | Seikagaku America | 120493-1 | ||
Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78429 | ||
Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | ||
GB004 blotting paper | Whatman | 10427926 | ||
GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman | 3030-917 | ||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |