Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet polysomales Profiling zur Isolierung von Translatomen, mRNAs, die mit Ribosomen assoziiert sind, in nicht-polysomale und polysomale RNAs aus Arabidopsis durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode demonstriert die Translationseffizienz von hitzegestresstem Arabidopsis.
Die translationale Kontrolle verschiedener Gene unter Hitzestress ist ein entscheidender Schritt für die Anpassung der Pflanzen an die Umwelt. Die Bewertung der translationalen Aktivitäten verschiedener Gene kann uns helfen, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Widerstandsfähigkeit von Pflanzen zugrunde liegen, und zur Entwicklung von Nutzpflanzen mit erhöhter Stresstoleranz angesichts des globalen Klimawandels beitragen. In diesem Artikel wird eine detaillierte Methodik zur Bewertung der Translationseffizienz durch Polysomen-Profiling in Pflanzen vorgestellt, die Hitzestress ausgesetzt sind. Das Verfahren gliedert sich in drei Teile: Hitzestressbehandlung für Arabidopsis, Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen und Berechnung der Translationseffizienz durch Isolierung von nicht-polysomaler und polysomaler RNA auf der Grundlage des Profils. Im ersten Teil werden Arabidopsis-Pflanzen kontrollierten Hitzestressbedingungen ausgesetzt, um Umwelteinflüsse nachzuahmen. Bei der Behandlung werden die Pflanzen für eine bestimmte Zeit hohen Temperaturen ausgesetzt, um eine konsistente und reproduzierbare Spannungsinduktion zu gewährleisten. Dieser Schritt ist entscheidend, um die physiologischen und molekularen Reaktionen der Pflanze auf Hitzestress zu untersuchen. Der zweite Teil befasst sich mit dem Test der Übersetzungseffizienz mittels Polysomenprofiling. Polysomen werden durch Saccharosegradientenzentrifugation extrahiert, bei der mRNAs basierend auf ribosomaler Beladung getrennt werden. Dies ermöglicht die Untersuchung der Ribosomenbelegung auf mRNAs und gibt Einblicke in die translationalen Kontrollmechanismen unter Stressbedingungen. Im dritten Teil wird RNA sowohl aus polysomalen als auch aus nicht-polysomalen Fraktionen isoliert. Spike-in-RNA wird verwendet, um die Menge an RNA in jeder Fraktion genau zu messen. Die Berechnung der Translationseffizienz erfolgt durch den Vergleich der Verteilung von mRNAs über diese Fraktionen unter Normal- und Hitzestressbedingungen. Die Translationsaktivitäten spezifischer Gene werden durch quantitative real-time PCR (qRT-PCR) mit Ribosomen-assoziierter RNA und Gesamt-RNA weiter bewertet. Diese Methodik konzentriert sich ausschließlich auf die Auswirkungen von Hitzestress und bietet ein detailliertes Protokoll zur Analyse der translationalen Regulation in Pflanzen.
Die Translation ist für Organismen von entscheidender Bedeutung, um funktionelle Proteine aus mRNA zu synthetisieren, die essentielle zelluläre Funktionen und biologische Prozesse wie Stoffwechsel und Signalübertragung unterstützen und Stressreaktionen ermöglichen. Ohne Translation können Zellen keine lebenswichtigen Proteine produzieren, was sich auf ihre Struktur, Funktion und Regulation auswirkt und dadurch die Erhaltung des Lebens und die Förderung der biologischen Vielfalt beeinträchtigt 1,2. Daher ist die Untersuchung der translationalen Effizienz von Pflanzen von entscheidender Bedeutung. Die Übersetzung umfasst mehrere wesentliche Schritte. Zunächst erfolgt die Initiation, wenn mRNA an ein Ribosom bindet, was durch Initiationsfaktoren wie eIFs in Eukaryoten erleichtert wird, die das Startcodon, typischerweise AUG, identifizieren. Als nächstes verläuft die Elongation, indem Transfer-RNA (tRNA)-Moleküle, die jeweils spezifische Aminosäuren tragen, nacheinander an das Ribosom binden. Zwischen benachbarten Aminosäuren bilden sich Peptidbindungen, die die Polypeptidkette entsprechend der mRNA-Sequenz verlängern. Schließlich wird die Terminierung eingeleitet, wenn auf ein Stoppcodon (UAA, UAG oder UGA) trifft, das durch Freisetzungsfaktoren erkannt wird, die das Ribosom dazu veranlassen, das neu synthetisierte Protein freizusetzen. Während der Translation arbeiten verschiedene eukaryotische Initiationsfaktoren (eIFs), Elongationsfaktoren und ribosomale RNAs zusammen, um Genauigkeit und Effizienz zu gewährleisten 3,4.
Frühere Studien haben gezeigt, dass posttranslationale Modifikationen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Interaktionen zwischen eIFs spielen und damit die Translationseffizienz beeinflussen. In-vitro-Untersuchungen haben gezeigt, dass CASEIN-KINASE-2 (CK2)-Kinase eIF3c, eIF5 und eIF2β phosphoryliert, um ihre Wechselwirkungen untereinander und mit eIF1 zu verstärken 5,6. Im Dunkeln unterdrückt die E3-Ligase CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) die Translation, indem sie die TOR-vermittelte Phosphorylierung von S6K-RPS6 hemmt. Das nicht-phosphorylierte RPS6 ist nicht in der Lage, funktionelle Ribosomen zu bilden, wodurch die Translation gestopptwird 7. Umgekehrt phosphoryliert die Suppressor of Phya 105 (SPA1)-Kinase unter Lichtbedingungen eIF2α, um den eIF2-Komplexaufbau zu erleichtern und die Translationsinitiierungzu fördern 8. Diese Ergebnisse unterstreichen die komplexen Kontrollmechanismen, die die Translation als Reaktion auf Umweltsignale regulieren.
Moderate Umweltreize können translationale Prozesse zur Erleichterung des Wachstums effektiv fördern, wie z. B. die Photomorphogenese 8,9. Wenn jedoch die Umweltfaktoren übermäßig stark sind, müssen immobile Pflanzen geeignete Regulationsmechanismen entwickeln, um die durch Umweltstress verursachten Schäden zu mildern10. In früheren Studien, die sich mit pflanzlichen Stressreaktionen befassten, konzentrierte sich die Mehrheit auf die Regulation auf metabolischer, hormoneller und transkriptioneller Ebene 11,12,13,14. Neuere Forschungen haben jedoch begonnen, den Einfluss der translationalen Regulation auf die Stresstoleranz von Pflanzen hervorzuheben 15,16,17. Pflanzen können ihre Stresstoleranz erhöhen, indem sie die Translationseffizienz reduzieren und so unnötigen Energieverbrauch minimieren. Aufgrund der Bildung von nicht-membranösen Stressgranula in Pflanzenzellen aggregieren untranslatierte mRNA und assoziierte Proteine in ihnen, um die Translationseffizienz zu verringern18. Einer der häufigsten Umweltstresse, denen Pflanzen häufig ausgesetzt sind, ist Hitzestress, von dem berichtet wurde, dass er die Bildung von Stressgranulaten in Pflanzenzellen induziert19,20. Der weltweite Anstieg der Durchschnittstemperaturen aufgrund der globalen Erwärmung wirkt sich stark auf die Ernteerträgeaus 21. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die physiologische Regulation von Pflanzen unter Hitzestress zu untersuchen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die Wärmebehandlung von Weizen zu einer Abnahme der polysomengebundenen mRNA führte. In Stressgranula gespeicherte mRNAs wurden jedoch freigesetzt und wieder an Ribosomen gebunden, was die Translation nach der Genesung erleichterte22. Darüber hinaus wurde in früheren Forschungen die Genexpression zwischen gesamter mRNA und polysomgebundener mRNA in submersen Pflanzen verglichen16. Die Ergebnisse zeigten, dass die Steady-State-Spiegel von mRNA, die mit Abscisinsäure und abiotischen Stressantworten assoziiert sind, nach dem Untertauchen leicht anstiegen. Darüber hinaus nahm die Menge an polysomengebundenen mRNAs deutlich zu. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Translationsregulation eine wichtigere Rolle bei der Kontrolle der Stresstoleranz in Pflanzen spielen könnte. Daher ist eine effektive Methode zur Isolierung polysomaler RNA entscheidend für die Untersuchung des Translatoms von stressbehandelten Proben.
In diesem Protokoll haben wir die RNA-Isolierungsmethode von der risikoreichen und voluminösen Phenol/Chloroform-Extraktion mit der LiCl-Fällungsmethode auf die kleinskalige Phenol/Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsmethode modifiziert, die weniger Volumen benötigt. Die erste Methode beinhaltet das direkte Mischen mit polysomalen Fraktionen, was zu einem größeren Versuchsabfall führt 9,15,23. Im Gegensatz dazu nutzt dieser modifizierte Ansatz das Prinzip der differentiellen Dichte: Polysomale RNA wird zunächst mit einer salzreichen, zuckerfreien Lösung gemischt und dann durch Ultrazentrifugation gefällt. Anschließend wird die RNA-Extraktion unter Verwendung eines kleinen Volumens des Phenol/Guanidiniumthiocyanat-Reagenzes durchgeführt. Diese Methode reduziert effektiv die Entstehung von organischem Abfall und macht unser Experiment umweltfreundlicher. Darüber hinaus weisen die verwendeten organischen Lösungsmittel eine geringere Toxizität auf. Diese Gründe haben uns dazu bewogen, die Versuchsverfahren entsprechend anzupassen und zu verbessern. Darüber hinaus lieferten frühere Methoden kein umfassendes Protokoll zur Berechnung der Translationseffizienz mithilfe der Spike-in-Normalisierung, die für tiefergehende translatomare Analysen unerlässlich ist.
Hier beschreiben wir das Polysomen-Profiling und das polysomale RNA-Isolierungsprotokoll zur Untersuchung der Translationseffizienz und translatomare Analysen in Arabidopsis unter Hitzeschockstress. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Translationseffizienz im Col-0-Wildtyp unter Normal-, Hitzeschock- und Nacherholungsbedingungen zu bewerten. Die Ergebnisse der Polysomen-Profilierung und der prozentuale Anteil an polysomaler RNA zeigten Veränderungen in der Translationseffizienz nach Hitzestressbehandlung bei Arabidopsis-Sämlingen .
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und standardisierte Methode zur Messung der Translationseffizienz von Arabidopsis-Sämlingen. Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die Sicherstellung der RNA-Stabilität durch Sekundärzentrifugation und RNA-Extraktionsreagenzienextraktion sowie die sorgfältige Vorbereitung des Saccharosegradienten. Darüber hinaus bieten wir kritische Schritte zur Normalisierung und Quantifizierung der nicht-polysomalen und polysomalen RNA mit der Spi…
The authors have nothing to disclose.
Wir würdigen die technischen Forschungsdienstleistungen für Ultrazentrifugen von Technology Commons am College of Life Science und dem Instrumentation Center, das vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie der National Taiwan University (Taiwan) gesponsert wird. Wir danken auch Yu-Ling Liang für die technische Unterstützung und den Mitgliedern des Cheng-Labors für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das Young Scholar Fellowship Einstein Program des National Science and Technology Council in Taiwan unter der Fördernummer unterstützt. NSTC 113-2636-B-002-007 bis M.-C.C. M.-C.C. bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch die National Taiwan University.
1.5 mL eppendorf tube | Labcon | 3012-870-000-9 | RNA extraction |
13.2 mL centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | ultracentrifugation |
Bromophenol blue | Honeywell | 32712 | Polysome profile |
Chloroform | Honeywell | 32211 | RNA extraction |
Cycloheximide (CHX) | Sigma-Aldrich | SI-C7698 | Polysome profile |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | RNA extraction |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | RNA extraction |
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit | Invitrogen | 900433 | Normalization |
Glycerol | Honeywell | 15523 | Normalization |
Heparin | Sigma-Aldrich | SI-H3149 | Polysome profile |
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit | Vazyme | R323-01 | Normalization |
KCl | J.T.Baker | 3040-01 | Polysome profile |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | SI-M8266 | Polysome profile |
MS basal medium | Phyto | M524 | Plant culture |
Peak Chart Syringe Pump | Brandel | SYN4007LS | Polysome profile |
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE) | Sigma-Aldrich | P2393 | Polysome profile |
RNasin | Promega | N251B | Polysome profile |
Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | SI-D6750 | Polysome profile |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5391 | Polysome profile |
SYBR Green Supermix | Bio-Rad | BP170-8882 | Normalization |
TRI reagent | MRC | TR118 | RNA extraction |
Tris-HCl | J.T.Baker | 4109-06 | Polysome profile |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100K | ultracentrifugation |
UV/VISDETECTOR | Brandel | UA-6 | Polysome profile |