Hier wird ein Protokoll für die Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in Seidenraupenlarven der Bombyx mori vorgestellt, um Gen-Silencing durch Verschlucken zu induzieren.
Die Seidenraupe, Bombyx mori, ist ein wichtiges Wirtschaftsinsekt mit einer jahrtausendealten Geschichte in China. Mittlerweile ist die Seidenraupe das Modellinsekt der Schmetterlinge mit einer guten Ansammlung von Grundlagenforschung. Es ist auch das erste Insekt bei Schmetterlingen, dessen vollständiges Genom sequenziert und zusammengesetzt wurde, was eine solide Grundlage für die Erforschung der Genfunktion bietet. Obwohl RNA-Interferenz (RNAi) in der reversen Genfunktionsforschung weit verbreitet ist, ist sie bei Seidenraupen und anderen Lepidopterenarten refraktär. Frühere erfolgreiche RNAi-bezogene Forschungen zur Verabreichung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) wurden ausschließlich durch Injektion durchgeführt. Die Verabreichung von dsRNA durch Fütterung wird nie berichtet. In diesem Artikel beschreiben wir Schritt für Schritt Verfahren zur Herstellung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel, die durch Verschlucken an die Seidenraupenlarven verfüttert werden. Das Protokoll umfasst (i) die Auswahl des geeigneten Stadiums der Seidenraupenlarven, (ii) die Synthese von dsRNA, (iii) die Herstellung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel und (iv) die Fütterung der Seidenraupenlarven mit Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln. Repräsentative Ergebnisse, einschließlich der Bestätigung des Gentranskripts und der Beobachtung des Phänotyps, werden vorgestellt. Die dsRNA-Fütterung ist eine einfache Technik für RNAi in Seidenraupenlarven. Da Seidenraupenlarven leicht zu züchten und groß genug sind, um sie zu betreiben, bietet sie ein gutes Modell zum Nachweis von RNAi von Larven bei Insekten. Darüber hinaus regt die Einfachheit dieser Technik die Beteiligung der Schüler an der Forschung an, was Seidenraupenlarven zu einem idealen genetischen System für den Einsatz im Klassenzimmer macht.
Die Seidenraupe, Bombyx mori, ist ein Insekt, das vor mehr als 5000 Jahren in China domestiziert wurde. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Seide zu produzieren, ist die Seidenraupe ein wichtiges Nutzinsekt in der chinesischen Landwirtschaft und Seidenzucht. Die Seidenraupe steht nach der Fruchtfliege als Modellinsekt an zweiter Stelle. Als Modellinsekt bei den Schmetterlingen ist die Seidenraupe leicht zu züchten, mit einer großen Körpergröße und vielen Mutanten. Inzwischen ist die Seidenraupe das erste Lepidoptera-Insekt, dessen vollständiges Genom sequenziert wurde1. Viele Datenbanken mit Informationen für Genom2, Transkriptom3, exprimiertes Sequenz-Tag (EST)4, nicht-kodierende RNA5 und Mikrosatellit6 sind ebenfalls für die Öffentlichkeit zugänglich. Die oben genannten Fakten machen die Seidenraupe zu einem perfekten Modell für die Genforschung.
RNA-Interferenz (RNAi) ist ein zellulärer Prozess, bei dem doppelsträngige RNA (dsRNA)-Moleküle die komplementäre Boten-RNA (mRNA) binden und in Scheiben schneiden, wodurch der Silencing-Effekt des Zielgens erreicht wird. Dieser Mechanismus ist in Bakterien natürlich vorhanden, um sich gegen das Eindringen von Viren zu verteidigen7. Später wurde festgestellt, dass RNAi in Tieren, Pflanzen und Mikroben konserviert ist. Aufgrund ihres starken sequenzspezifischen Silencing-Effekts wird RNAi in der Grundlagenforschung eingesetzt, um die Genexpression zu manipulieren und die Genfunktion zu untersuchen. RNAi wird durch die Abgabe von dsRNA in die Zellen erreicht.
Bei Insekten gibt es drei gängige Möglichkeiten, dsRNA zu verabreichen, nämlich Mikroinjektion, Fütterung und Einweichen8. Zurzeit werden erfolgreiche RNAi-Berichte in den Seidenraupen durch nackte dsRNA-Verabreichung durch dsRNA-Injektion durchgeführt9. Die Vorteile der Mikroinjektion sind die sofortige Abgabe von dsRNA in die Hämolymphe und die präzise Kontrolle der dsRNA-Menge. Es gibt jedoch auch gewisse Nachteile der Mikroinjektion. Zum Beispiel ist es zeitaufwändig und erfordert empfindliche Geräte. Es ist auch wichtig, die Injektionsnadeln, das Injektionsvolumen und die dsRNA-Menge zu optimieren. Daher wird ein alternativer Weg zur Verabreichung von dsRNA an Seidenraupen notwendig. Da das Exoskelett eines Insekts eine wasserdichte Barriere ist, die aus Chitin besteht, wird selten über das Einweichen von Insektenlarven berichtet, um RNAi zu erhalten, was für RNAi bei Insekten keine gute Option ist. Die Fütterung von dsRNA ist arbeitssparend, kostengünstig und einfach durchzuführen10. Diese Methode ist auch für das Hochdurchsatz-Genscreening anwendbar11. Es zeigt sich jedoch, dass eine DNA/RNA-unspezifische Nuklease, nämlich BmdsRNase, im Mitteldarm und Mitteldarmsaft der Seidenraupenlarven vorhanden ist12. Es wird gezeigt, dass diese Nuklease dsRNA, vorzugsweise13, verdaut. Daher scheint es schwierig zu sein, der Seidenraupe nackte dsRNA zu füttern, um die Genexpression zum Schweigen zu bringen.
In jüngster Zeit hat sich gezeigt, dass nanopartikelabgeschirmte dsRNA eine gute Alternative ist, um die RNAi-Effizienz durch Fütterung von14 zu erhöhen. Chitosan ist ein kostengünstiges, ungiftiges und biologisch abbaubares Polymer, das durch Deacetylierung von Chitin hergestellt werden kann, einem natürlich vorkommenden und nach Cellulose15 das am zweithäufigsten vorkommende Biopolymer. Da die Aminogruppe im Chitosan positiv geladen und die Phosphatgruppe auf dem Rückgrat der dsRNA negativ geladen ist, könnten die Chitosan/dsRNA-Nanopartikel durch Selbstorganisation von Polykationengebildet werden 16. Chitosan/dsRNA-Nanopartikel sind wirksam bei der Gewinnung von RNAi durch Larvenfütterung bei Stechmücken wie Aedes aegypti und Anopheles gambiae17, dem Baumwollfleckenkapselwurm Earias vittella18 und der Karminspinnmilbe Tetranychus cinnabarinus19.
Um eine Methodik für die dsRNA-Verabreichung durch Fütterung von Seidenraupen zu entwickeln, um eine erfolgreiche RNAi-Effizienz zu erreichen, konzentriert sich dieser Bericht auf die Beschreibung von Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Vorbereitung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel und zur Verfütterung der Nanopartikel an die Seidenraupenlarven. Diese Methode ist relativ kostengünstig, arbeitssparend und einfach zu befolgen und kann für Gen-Silencing-Studien an anderen Insekten angepasst werden. Unser Ziel ist es, ein einfacheres Protokoll für die Lepidoptera-dsRNA-Verabreichungsmethode mit höherer RNAi-Effizienz bereitzustellen.
Ein geeignetes Stadium ist wichtig für die Beobachtung des RNAi-Phänotyps, abhängig von den Zielgenen. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigten, dass Toll9-2 am Wachstum der Seidenraupe beteiligt ist. Die Größe und das Gewicht der Seidenraupenlarven nehmen im 5. Stadium21 rapide zu. Daher werden die Larven des 5. Stadiums als Bühne für das Fütterungsexperiment mit Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln ausgewählt. Es ist auch möglich, …
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (31501898), dem Science and Technology Program von Guangzhou (202102010465), dem Guangzhou Higher Education Teaching Quality and Teaching Reform Project (2022JXGG057) und dem Forschungsprojekt des Open Online Course Steering Committee der Guangdong Provincial Universities (2022ZXKC381) finanziert.
1.5 mL centrifuge tube | Sangon | F601620 | for dsRNA or nanoparticles reaction |
10 μl pipette | Eppendorf | P13473G | to aspirate or resuspend liquid |
100 μl pipette | Eppendorf | Q12115G | to aspirate or resuspend liquid |
2.5 μl pipette | Eppendorf | P20777G | to aspirate or resuspend liquid |
20 μl pipette | Eppendorf | H19229E | to aspirate or resuspend liquid |
200 μl pipette | Eppendorf | H20588E | to aspirate or resuspend liquid |
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Costar | 3516 | for silkworm rearing individually |
Acetic acid | Aladdin | A116165 | to make TAE |
Agarose M | BBI Life Sciences | A610013 | for agarose gel electrophosis |
Analytical balance | Sartorius | BSA224S | to weight ingredients |
Centrifuge | Sartorius | Centrisart A-14C | to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles |
Chitosan | Sigma-Aldrich | C3646 | to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles |
EDTA | Sangon | A500895 | to make TAE |
Ethanol | Aladdin | E130059 | to make TAE, or for dsRNA precipitation |
Freezer | Siemens | iQ300 | to store dsRNA or nanoparticles |
GoTaq Green Master Mix | Promega | M712 | for PCR reaction |
GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | for qRT-PCR reaction |
Isopropanol | Aladdin | I112011 | for dsRNA precipitation |
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | One | to determine the concentration of dsRNA |
ph meter | Sartorius | PB-10 | to prepare buffers |
SanPrep Column PCR Product Purification Kit | Sangon | B518141 | for PCR product purification |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | to make 100 mM sodium acetate buffer |
Sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | to make 100 mM sodium sulfate buffer |
T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | for dsRNA synthesis |
ThermoMixer | Eppendorf | C | for dsRNA generation or nanoparticles heating |
Tris | Sangon | A501492 | to make TAE |
Vortex | IKA | Vortex 3 | to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles |