Einführende Analyse und Validierung von CUT&RUN-Sequenzierungsdaten

Die Fähigkeit, Wechselwirkungen zwischen Proteinen und genomischer DNA zu messen, ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Biologie der Chromatinregulation. Effektive Assays, die die Chromatinbelegung für ein bestimmtes Protein messen, liefern mindestens zwei Schlüsselinformationen: i) die genomische Lokalisierung und ii) die Proteinhäufigkeit in einer bestimmten genomischen Region. Die Verfolgung der Rekrutierungs- und Lokalisierungsänderungen eines Proteins von Interesse im Chromatin kann direkte Zielloci des Proteins aufdecken und mechanistische Rollen dieses Proteins in chromatinbasierten biologischen Prozessen wie der Regulation der Transkription, der DNA-Reparatur oder der DNA-Replikation aufdecken. Die heute verfügbaren Techniken zur Profilierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglichen es Forschern, die Regulation mit beispielloser Auflösung zu erforschen. Solche technischen Fortschritte wurden durch die Einführung neuer Chromatin-Profiling-Techniken ermöglicht, zu denen auch die Entwicklung von Cleavage Under Targets und Release Using Nuclease (CUT&RUN) durch das Henikoff-Labor gehört. CUT&RUN bietet mehrere technische Vorteile gegenüber der herkömmlichen Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), darunter geringere Anforderungen an den Zelleinsatz, geringere Anforderungen an die Sequenzierungstiefe und eine erhöhte Empfindlichkeit mit reduziertem Hintergrundsignal aufgrund eines Mangels an Vernetzungsmitteln, die sonst Antikörper-Epitope maskieren. Die Anwendung dieser Technik zur Untersuchung der Chromatinregulation erfordert ein gründliches Verständnis des Prinzips, das der Technik zugrunde liegt, und ein Verständnis dafür, wie CUT&RUN-Daten analysiert, validiert und interpretiert werden.

Das CUT&RUN-Verfahren beginnt mit der Bindung von Zellen an Concanavalin A, das an magnetische Kügelchen konjugiert ist, um eine Manipulation geringer Zellzahlen während des gesamten Verfahrens zu ermöglichen. Isolierte Zellen werden mit einem milden Detergens permeabilisiert, um die Einführung eines Antikörpers zu erleichtern, der auf das gewünschte Protein abzielt. Die Mikrokokken-Nuklease (MNase) wird dann mit Hilfe eines Protein-A- oder Protein-A/G-Tags, das an das Enzym gebunden ist, an den gebundenen Antikörper rekrutiert. Kalzium wird eingeführt, um die enzymatische Aktivität zu initiieren. Der MNase-Verdau führt zu mononukleosomalen DNA-Protein-Komplexen. Anschließend wird Calcium chelatisiert, um die Verdauungsreaktion zu beenden, und kurze DNA-Fragmente aus dem MNase-Verdau werden aus den Zellkernen freigesetzt und dann einer DNA-Reinigung, einer Bibliotheksvorbereitung und einer Hochdurchsatzsequenzierung^{unterzogen 1} (Abbildung 1).

In-silico-Ansätze zur Kartierung und Quantifizierung der Proteinbelegung im gesamten Genom haben sich parallel zu den Nasslaboransätzen entwickelt, die zur Anreicherung dieser DNA-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden. Die Identifizierung von Regionen angereicherter Signale (Peaks) ist einer der wichtigsten Schritte in der bioinformatischen Analyse. Erste ChIP-seq-Analysemethoden verwendeten Algorithmen wie MACS² und SICER³, die statistische Modelle verwendeten, um Bona-fide-Protein-DNA-Bindungsstellen aus dem Hintergrundrauschen zu unterscheiden. Das geringere Hintergrundrauschen und die höhere Auflösung der CUT&RUN-Daten machen jedoch einige Peak-Calling-Programme, die in der ChIP-seq-Analyse verwendet werden, für die CUT&RUN-Analyse ungeeignet⁴. Diese Herausforderung unterstreicht den Bedarf an neuen Werkzeugen, die besser für die Analyse von CUT&RUN-Daten geeignet sind. SEACR⁴ stellt ein solches Tool dar, das kürzlich entwickelt wurde, um Spitzenaufrufe von CUT&RUN-Daten zu ermöglichen und gleichzeitig die Einschränkungen zu überwinden, die mit Tools verbunden sind, die typischerweise für die ChIP-seq-Analyse eingesetzt werden.

Biologische Interpretationen aus CUT&RUN-Sequenzierungsdaten werden aus den Ausgängen nach dem Peak-Aufruf in der Analysepipeline gezogen. Es können verschiedene funktionale Annotationsprogramme implementiert werden, um die potentielle biologische Relevanz der aufgerufenen Peaks aus CUT&RUN-Daten vorherzusagen. Zum Beispiel bietet das Projekt Gene Ontology (GO) eine gut etablierte funktionelle Identifizierung von Genen von Interesse ^5,6,7. Verschiedene Software-Tools und Ressourcen erleichtern die GO-Analyse, um Gene und Gensätze aufzudecken, die unter den CUT&RUN-Peaks 8,9,10,11,12,13,14 angereichert sind. Darüber hinaus ermöglichen Visualisierungssoftware wie Deeptools¹⁵, Integrative Genomics Viewer (IGV)¹⁶ und UCSC Genome Browser¹⁷ die Visualisierung von Signalverteilung und -mustern in interessanten Regionen des Genoms.

Die Fähigkeit, biologische Interpretationen aus CUT&RUN-Daten zu ziehen, hängt entscheidend von der Validierung der Datenqualität ab. Zu den kritischen Komponenten, die validiert werden müssen, gehören die Bewertung von: i) der Qualität der CUT&RUN-Bibliothekssequenzierung, ii) der Replikatähnlichkeit und iii) der Signalverteilung in den Peakzentren. Der Abschluss der Validierung aller drei Komponenten ist entscheidend, um die Zuverlässigkeit der CUT&RUN-Bibliotheksproben und der nachgelagerten Analyseergebnisse zu gewährleisten. Daher ist es wichtig, einführende CUT&RUN-Analyseleitfäden zu erstellen, die es Bioinformatik-Anfängern und Nasslaborforschern ermöglichen, solche Validierungsschritte als Teil ihrer Standard-CUT&RUN-Analysepipelines durchzuführen.

Neben der Entwicklung des CUT&RUN-Experiments im Nasslabor wurden verschiedene in silico CUT&RUN-Analysepipelines wie CUT&RUNTools 2.0^18,19, nf-core/cutandrun 20 und CnRAP²¹ entwickelt, um die CUT&RUN-Datenanalyse zu unterstützen. Diese Werkzeuge bieten leistungsstarke Ansätze für die Analyse von Einzelzell- und Massen-CUT&RUN- und CUT&Tag-Datensätzen. Die relativ komplexe modulare Programmstruktur und die erforderliche Vertrautheit mit mehreren Programmiersprachen zur Durchführung dieser Analysepipelines können jedoch die Einführung durch Bioinformatik-Anfänger behindern, die die CUT&RUN-Analyseschritte gründlich verstehen und ihre eigenen Pipelines anpassen möchten. Um diese Barriere zu umgehen, ist eine neue einführende CUT&RUN-Analysepipeline erforderlich, die in einfachen Schritt-für-Schritt-Skripten bereitgestellt wird, die mit einer einfachen Programmiersprache codiert sind.

In diesem Artikel beschreiben wir ein einfaches, einsprachiges CUT&RUN-Analyse-Pipeline-Protokoll, das Schritt-für-Schritt-Skripte mit detaillierten Beschreibungen bereitstellt, um neuen und unerfahrenen Benutzern die Durchführung von CUT&RUN-Sequenzierungsanalysen zu ermöglichen. Programme, die in dieser Pipeline verwendet werden, sind von den ursprünglichen Entwicklergruppen öffentlich verfügbar. Zu den wichtigsten Schritten, die in diesem Protokoll beschrieben werden, gehören das Read-Alignment, das Peak-Calling, die Funktionsanalyse und vor allem Validierungsschritte zur Bewertung der Probenqualität, um die Eignung und Zuverlässigkeit der Daten für die biologische Interpretation zu bestimmen (Abbildung 2). Darüber hinaus bietet diese Pipeline den Nutzern die Möglichkeit, Analyseergebnisse mit öffentlich zugänglichen CUT&RUN-Datensätzen zu vergleichen. Letztendlich dient dieses CUT&RUN-Analyse-Pipeline-Protokoll als Einführungsleitfaden und Referenz für Einsteiger in die bioinformatische Analyse und Nasslaborforscher.