Das Protokoll beschreibt die Züchtung resistenter Stärkereissorten durch Design unter Verwendung von Genome-Editing-Technologien auf präzise, effiziente und technisch einfache Weise.
Die konventionellen Ansätze der Pflanzenzüchtung, die überwiegend auf zeit- und arbeitsintensiven Methoden wie der traditionellen Hybridisierung und Mutationszüchtung beruhen, stehen vor Herausforderungen, wenn es darum geht, gezielte Merkmale effizient einzuführen und vielfältige Pflanzenpopulationen zu erzeugen. Umgekehrt hat das Aufkommen von Genome-Editing-Technologien einen Paradigmenwechsel eingeleitet, der eine präzise und beschleunigte Manipulation von Pflanzengenomen ermöglicht, um gewünschte Eigenschaften absichtlich einzuführen. Eines der am weitesten verbreiteten Bearbeitungswerkzeuge ist das CRISPR/Cas-System, das von Forschern verwendet wird, um wichtige biologische Probleme zu untersuchen. Der präzise und effektive Arbeitsablauf der Genom-Editierung ist in der Pflanzenzüchtung jedoch noch nicht genau definiert. In dieser Studie haben wir den gesamten Prozess der Züchtung von Reissorten demonstriert, die mit einem hohen Anteil an resistenter Stärke (RS) angereichert sind, einem funktionellen Merkmal, das eine entscheidende Rolle bei der Vorbeugung von Krankheiten wie Diabetes und Fettleibigkeit spielt. Der Arbeitsablauf umfasste mehrere wichtige Schritte, wie z. B. die Auswahl des funktionellen SBEIIb-Gens , das Design der Single-Guide-RNA (sgRNA), die Auswahl eines geeigneten Genom-Editing-Vektors, die Bestimmung der Vektorverabreichungsmethode, die Durchführung von Pflanzengewebekulturen, die Genotypisierung, die Mutation und die phänotypische Analyse. Darüber hinaus wurde der Zeitrahmen, der für jede Phase des Prozesses erforderlich ist, klar aufgezeigt. Dieses Protokoll rationalisiert nicht nur den Züchtungsprozess, sondern verbessert auch die Genauigkeit und Effizienz der Einführung von Merkmalen und beschleunigt so die Entwicklung funktioneller Reissorten.
Die traditionelle Züchtung beruht auf der Einführung von Merkmalen in Kulturpflanzen oder der Erzeugung von Pflanzenpopulationen mit ausreichender Variation, was eine langfristige Feldbeobachtung erfordert 1,2. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen Züchtung wurde eine Gen-Editing-Technologie entwickelt, die das Genom von Nutzpflanzen präzise modifizieren kann, um die gewünschten Merkmale von Pflanzenpopulationen zu erhalten3. Das am weitesten verbreitete Gen-Editing-System in Pflanzen ist CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), das auf einer programmierbaren RNA-gesteuerten Endonuklease beruht, um gezielte Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA zu erzeugen 4,5. Diese DSBs werden dann durch die natürlichen DNA-Reparaturmechanismen der Zelle repariert 6,7, was oft zur Einführung der gewünschten genetischen Veränderungen führt. Obwohl diese Technologie in verschiedenen Kulturen eingesetzt wurde, darunter Weizen8, Mais9, Sojabohnen10 und Reis11, wird sie hauptsächlich zur Aufdeckung biologischer Probleme eingesetzt. Verglichen mit ihrer umfangreichen Anwendung bei der Aufklärung der Genfunktionen von Pflanzen ist die Forschung zur Anwendung von Gen-Editing-Technologien in der Pflanzenzüchtung noch relativ spärlich12.
Der Prozess der Gen-Editierung bei Nutzpflanzen folgt in der Regel einem klar definierten Arbeitsablauf, der mehrere wichtige Schritte umfasst13. Der erste Schritt besteht darin, das spezifische Gen oder die genetische Region zu identifizieren, die modifiziert werden muss, um das gewünschte Merkmal zu erreichen. Zweitens wird eine Gen-Editing-Strategie entwickelt, die die Auswahl eines geeigneten Gen-Editing-Systems (z. B. CRISPR-Cas9 oder CRISPR-Cas12) und das Design spezifischer Guide-RNAs umfasst, um die Endonuklease zum Zielort zu leiten. Drittens wird das Gen-Editing-System dann in einen Verabreichungsvektor eingebaut, mit dem die Editierungsmaschinerie in die Pflanzenzellen eingeführt wird. Bei diesen Vektoren kann es sich um DNA-, RNA- oder Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) handeln. Anschließend werden die Gen-Editing-Vektoren mit verschiedenen Methoden, darunter Agrobacterium-vermittelte Transformation, Partikelbeschuss oder Elektroporation, in Pflanzenzellen eingebracht. Sofort werden die transformierten Pflanzenzellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um genetisch veränderten Kallus oder embryogenes Gewebe zu erzeugen. Diese Gewebe werden dann durch Gewebekulturtechniken zu ganzen Pflanzen regeneriert. Die regenerierten Pflanzen werden einer strengen molekularen Charakterisierung unterzogen, um das Vorhandensein der gewünschten genetischen Veränderungen zu bestätigen.
Ein früherer Artikel von Tsakirpaloglou et al.14 bietet einen umfassenden Überblick über den Gen-Editing-Prozess, vom Vektordesign bis zur Erzeugung editierter Sämlinge, geht aber weder auf die detaillierte Analyse spezifischer Merkmale ein, die mit dem Zielgen verbunden sind, noch auf die anschließende Bewertung der agronomischen Leistung oder der funktionellen Validierung der editierten Pflanzen. Wir sind mehr als nur der Nachweis der Machbarkeit der Editierung eines Gens in Reis gegangen. Unsere Arbeit bewertet umfassend die Auswirkungen dieser Bearbeitung auf die biochemischen, molekularen und agronomischen Eigenschaften der editierten Reislinien. Dazu gehört auch die Bewertung der Stärkezusammensetzung, ein kritischer Faktor, der die Getreidequalität und den Nährwert beeinflusst und in früheren Gen-Editing-Studien nicht umfassend untersucht wurde.
Reisstärke besteht typischerweise aus ~20% Amylose und ~80% Amylopektin15. SBEIIb ist ein Enzym, das für die Amylopektinsynthese essentiell ist und im Endospermexprimiert wird 16. Der Knockdown von OsSBEIIb durch Hairpin-RNA (RNAi) und microRNA-Expression erhöhte den Gehalt an resistenter Stärke17,18. Resistente Stärke ist ein Substratstärke, das im Dünndarm nicht verdaut und aufgenommen werden kann, aber von bestimmten Verdauungsbakterien im Darm in kurzkettige Fettsäuren und Gase zerlegt werden kann. Da es nicht schnell abgebaut werden kann, hat es im Vergleich zu anderen Stärken einen niedrigeren glykämischen Index und verursacht innerhalb kurzer Zeit nach dem Essen keinen schnellen Anstieg des Blutzuckers, was Diabetes in der Diät bis zu einem gewissen Grad lindern kann19. Darüber hinaus hat resistente Stärke physiologischere Funktionen, wie z. B. die Verringerung der Insulinreaktion, die Regulierung der Darmfunktion, die Verhinderung von Fettansammlungen, die Erleichterung der Gewichtskontrolle und die Förderung der Aufnahme von Mineralionen. Daher wird es weithin als neue Art von Ballaststoffen verfolgt20.
Um diese Herausforderungen zu meistern und Gen-Editing-Technologien erfolgreich für die Züchtung funktioneller Reissorten einzusetzen, haben wir die Betriebsprotokolle innerhalb von Reis verfeinert und optimiert. Unser Fokus lag auf der sorgfältigen Analyse des Designs der Zielgenloci, der sorgfältigen Auswahl der am besten geeigneten Gen-Editing-Tools und der Durchführung einer rigorosen phänotypischen Analyse während des gesamten Züchtungsprozesses. Als Beweis für die Leistungsfähigkeit und Effizienz dieser Technologien präsentieren wir eine Fallstudie, die die schnelle Entwicklung einer funktionellen Reissorte zeigt, die mit hochresistenter Stärke angereichert ist. Dieses Beispiel unterstreicht das Potenzial der Gen-Editierung, die Züchtung von funktionellem Reis zu beschleunigen und den derzeitigen Mangel an Forschung in diesem Bereich zu beheben.
Bei der Konstruktion von CRISPR/Cas-SF01-basierten Knockdown-Vektoren ist die sorgfältige Auswahl von Single-Guide-RNAs (sgRNA) von entscheidender Bedeutung. Dies erfordert die Verwendung von Sequenzen, die eine hohe Bearbeitungseffizienz mit minimalen Off-Target-Effekten aufweisen. Darüber hinaus enthält die Synthese von Targeting-Primern kurze Adapter-Oligos, die zu den Spleißstellen des Vektors passen, um eine nahtlose Integration zu gewährleisten. Im Gegensatz zu früheren Metho…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus den Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074) unterstützt.
2 x Taq Plus Master Mix II | Vazyme Biotech Co.,Ltd | P213 | Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes |
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio | Phyto Technology | D309 | |
AAM medium | Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd | M9051C | |
BsaI-HF | New england biolabs | R3535 | Bsa I enzyme digestion of the editing vector |
Carbenicillin antibiotics | Applygen | APC8250-5 | Selection medium, regeneration medium |
Casaminoacid | BBI-Life SciencesCorporation | A603060-0500 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
DH5α Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | DL1001 | E. coli competent cells |
D-Sorbitol | BBI-Life SciencesCorporation | A610491-0500 | |
EDTA,disodium salt,dihydrate | Diamond | A100105-0500 | CTAB buffer |
EHA105 Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | AC1010 | Agrobacterium competent cells |
FastPure Plasmid Mini Kit | Vazyme Biotech Co.,Ltd | REC01-100 | Plasmid isolated |
Hygromycin antibiotics | Yeasen | 60224ES | co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium |
Kanamycin antibiotics | Yeasen | 60206ES10 | Selection agrobacterium |
KOH | Macklin | P766798 | CTAB buffer |
L-Glutamine | Phyto Technology | G229 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
L-Proline | Phyto Technology | P698 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) | – | – | Japonica varieties for breeding RS rice |
Mill rice mechine | MARUMASU | MHR1500A | To produce white rice |
Murashige Skoog | Phyto Technology | M519 | Root medium, regeneration medium |
Myo-inositol | Phyto Technology | I703 | Regeneration medium |
NaCl | Macklin | S805275 | For YEP media |
NB Basal Medium | Phyto Technology | N492 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Peptone | Solarbio | LA8800 | For YEP media |
Phytogel | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S24793 | |
Pot | Midea group Co. | MB-5E86 | For cooking rice |
Refrigerator | Haier | BCD-170 | Storage the medium |
Resistant Starch Assay Kit | Megazyme | K-RSTAR | Measurement and analysis resistant starch |
Rifampicin antibiotics | Sigma | R3501-250MG | Selection agrobacterium |
Sodium hypochlorite solution | Macklin | S817439 | For seed sterilization |
Sucrose | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | B21647 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
T4 DNA Ligase | New england biolabs | M0202 | Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector |
The glucose monitor | Medical Equipment & Supply Co., Ltd | Xuetang 582 | Detection the blood glucose |
Tris-HCL | Macklin | T766494 | CTAB buffer |
Yeast Agar | Solarbio | LA1370 | For YEP media |
YEP media | – | – | Cultivation of Agrobacterium |