Summary

Messung von vier uterinen NK-Zell-Subtypen mittels multiplexierter fluoreszierender immunhistochemischer Färbung bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen

Published: October 25, 2024
doi:

Summary

Diese Studie stellt eine bahnbrechende Methode zur Quantifizierung von Untergruppen natürlicher Killerzellen der Gebärmutter während des Implantationsfensters unter Verwendung fortschrittlicher immunhistochemischer Multiplex-Fluoreszenz-Färbetechniken vor.

Abstract

Die Immunhistochemie (IHC) spielt eine entscheidende Rolle in der biologischen Forschung und klinischen Diagnose und ist die am häufigsten verwendete Methode zur Identifizierung und Visualisierung von Gewebeantigenen. Traditionelle IHC-Färbemethoden haben jedoch Einschränkungen bei der Unterscheidung verschiedener Subtypen von Immunzellen. Diese Herausforderung hat Wissenschaftler dazu veranlasst, neue Technologien und Methoden zur präzisen Identifizierung und Differenzierung von Immunzell-Subtypen zu erforschen. In den letzten Jahren hat sich die Multiplex-IHC als Lösung herauskristallisiert, die den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antigene und deren Visualisierung innerhalb derselben Gewebeprobe ermöglicht. Natürliche Killerzellen der Gebärmutter (uNK) spielen eine zentrale Rolle bei frühen Schwangerschaftsprozessen, einschließlich der Dezidualisierung, des Umbaus der Spiralarterien der Gebärmutter und der Embryonenimplantation. Verschiedene Subtypen von uNK-Zellen weisen unterschiedliche Funktionen auf, die es ihnen ermöglichen, verschiedene biologische Ereignisse für eine erfolgreiche Embryonalentwicklung und Schwangerschaft zu koordinieren. Daher ist eine eingehende Erforschung der uNK-Zellsubtypen unerlässlich, um die Mechanismen der Immunregulation während der Schwangerschaft aufzuklären. Solche Studien liefern wertvolle Erkenntnisse und neuartige Ansätze für die Behandlung verwandter Erkrankungen wie Unfruchtbarkeit und wiederkehrender Fortpflanzungsstörungen. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Multiplex-IHC-Färbeprotokoll zur Untersuchung der Dichte von vier Subtypen von uNK-Zellen in Endometriumproben während des Implantationsfensters (WOI) vorgestellt. Das Protokoll umfasst die Probenvorbereitung, die Optimierung von Subtyp-Markern, mikroskopische Bildgebung und Datenanalysen. Dieses Multiplex-IHC-Färbeprotokoll bietet eine hohe Spezifität und Sensitivität und ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis verschiedener uNK-Zell-Subtypen und bietet Forschern damit ein leistungsstarkes Werkzeug, um die Feinheiten und Mechanismen der Immunregulation während der Schwangerschaft zu erforschen.

Introduction

Die erste dokumentierte Lebendgeburt nach In-vitro-Fertilisation-Embryotransfer (IVF-ET) wurde 1978 berichtet. In den letzten 40 Jahren gab es bei unfruchtbaren Paaren eine hohe Nachfrage nach der Unterstützung durch IVF-ET1. Im Jahr 2021 begannen 238.126 Patienten in den Vereinigten Staaten mit insgesamt 413.776 IVF-Zyklen. Dies bedeutet einen Anstieg der Zyklen um 25 % gegenüber 2 Jahren zuvor und einen Anstieg um 135 % gegenüber 20122. Dieser Anstieg ist hauptsächlich auf die steigende Prävalenz von Unfruchtbarkeit und die verzögerte Planung einer Schwangerschaft zurückzuführen. Fortschritte bei Embryokulturtechniken und Superovulationsprotokollen haben zu einer erhöhten Lebendgeburtenrate pro ET-Zyklus geführt, die bei Frauen unter 40 Jahren 30%-50% und bei Frauen über 40 Jahren weniger als 30% erreicht2. Trotz dieser Fortschritte nistet sich jedoch immer noch mehr als die Hälfte der übertragenen Embryonen nicht ein. Wiederholtes Einnistungsversagen (RIF), typischerweise definiert als Versagen nach drei oder mehr aufeinanderfolgenden Versuchen, hochwertige Embryonen zu übertragen, betrifft 15% der Frauen, die sich einer IVF-ET3 unterziehen. Paare mit RIF sind extrem anfällig und anfälliger für teure und unnötige Eingriffe, die sie unangemessenen Risiken aussetzen können4. Daher ist es entscheidend, die Ursachen von RIF zu verstehen und die Einnistung des Embryos zu verbessern, um den Erfolg von IVF-ET zu verbessern, insbesondere für Frauen mit RIF. Die Vorbereitung des Endometriums ist entscheidend für eine erfolgreiche Einnistung des Embryos. Dieser Prozess ist gekennzeichnet durch eine signifikante Akkumulation von natürlichen Killerzellen der Gebärmutter (uNK), die von 30 % der gesamten Lymphozyten im Endometrium während der mittleren sekretorischen Phase auf 70 % bis 80 % in der Dezidua während der Frühschwangerschaft übergehen5. Bemerkenswert ist, dass sich uNK-Zellen von peripheren NK-Zellen unterscheiden, bei denen es sich um zytotoxische Lymphozyten handelt, die für das angeborene Immunsystem entscheidend sind und den Tod der infizierten Zellen durch Lyse oder Apoptose verursachen. Während die genauen Funktionen von uNK-Zellen noch nicht vollständig verstanden sind, deuten mehrere Hinweise darauf hin, dass sie am Remodeling der Angiogenese, der Trophoblasteninvasion und der Entwicklung des Fötus beteiligt sind6. Der Zusammenhang zwischen dem prozentualen Anteil von uNK-Zellen gegenüber Stromazellen und RIF hat in den letzten 20 Jahren große Anziehungskraft erlangt. Eine kürzlich durchgeführte Metaanalyse, die 8 Studien mit 604 Frauen umfasste, zeigte, dass die Dichte von CD56+uNK-Zellen während der mittleren Lutealphase bei Frauen mit RIF im Vergleich zu fruchtbaren Kontrollen signifikant erhöht ist7. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass sich die Eigenschaften von uNK-Zellen während der mittleren Lutealphase signifikant von denen von dezidualen NK-Zellen (dNK) unterscheiden. Obwohl sich uNK-Zellen nach der Schwangerschaft weiter in verschiedene Untergruppen von dNK-Zellen differenzieren können, repräsentiert die Messung von uNK-Zellen allein dNK-Zellen nicht genau8. uNK-Zellen durchlaufen eine dynamische Differenzierung und spielen unterschiedliche Rollen im Menstruationszyklus und in den Dezidualisierungsprozessen, was sie komplexer macht, als sie allein durch CD56 identifiziert werden können. Mehrere Marker sind erforderlich, um ein umfassendes Verständnis des Verhaltens von uNK-Zellen während der Endometriumpräparation zu erlangen. In unserer jüngsten Studie wurde die Einzelzell-RNA-Sequenzierung eingesetzt, um die Vielfalt von uNK-Zellen während des gesamten Menstruationszyklus zu identifizieren. Die Ergebnisse, die mit Hilfe der Durchflusszytometrie validiert wurden, zeigten das Vorhandensein von vier verschiedenen Subtypen von uNK-Zellen, die jeweils während des Menstruationszyklus dynamische Veränderungen zeigten9. Die Analyse der Genanreicherung und die funktionelle Anreicherung der Genontologie deuten darauf hin, dass diese uNK-Untergruppen in verschiedenen Stadien der Menstruation unterschiedliche Funktionen erfüllen. Dennoch ist die Durchflusszytometrie in klinischen Laboratorien nicht überall zugänglich, und die sofortige Verarbeitung von frischem Endometriumgewebe für den Enzymverdau macht es unmöglich, experimentelle Schritte bei Fehlern zu wiederholen.

Das Ziel dieser Studie war es daher, die Messung dieser vier Subpopulationen von NK-Zellen mit Hilfe eines Multiplex-Färbeassays zu untersuchen, der einen praktischeren diagnostischen Ansatz bietet. Bei der Mehrfachfärbung werden unterschiedliche spezifische Antikörper gegen jedes Ziel mit unterschiedlichen Fluorophormarkierungen verknüpft, die unterschiedliche Wellenlängen des Lichts emittieren, wenn sie durch eine bestimmte Lichtwellenlänge angeregt werden. Im Vergleich zur traditionellen IHC-Färbemethode kann diese Methode die relative Häufigkeit und Verteilung mehrerer Targets in einer Probe quantitativ vergleichen und Informationen über die Interaktion und Co-Lokalisation verschiedener Targets liefern, was es uns ermöglicht, verschiedene Subtypen von uNK-Zellen zu identifizieren. Dieser Ansatz wird nicht nur unser Verständnis der Beziehung zwischen uNK-Zellen und RIF vertiefen, sondern auch Erkenntnisse für die Untersuchung anderer Immunzell-Subpopulationen bei endometriumbedingten Erkrankungen liefern.

Protocol

Die Studie wurde von der Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (CREC-Ref.-Nr.: 2022.581) genehmigt. Frauen mit RIF wurden vom Assisted Reproductive Technology Center des Prince of Wales Hospital der Chinese University of Hong Kong rekrutiert. RIF wurde definiert als das Scheitern einer klinischen Schwangerschaft nach dem Transfer von mindestens 4 Embryonen guter Qualität in mindestens 3 frischen oder gefrorenen Zyklen bei e…

Representative Results

Um den Zeitpunkt der Entnahme von Endometriumproben bei Frauen, die sich dem natürlichen Zyklus unterziehen, konsistent zu halten, wurde ein Urintest durchgeführt, um ihren Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH) genau nachzuweisen, wobei 7 Tage nach dem LH-Anstieg Endometriumbiopsien durchgeführt wurden. Bei Frauen, die sich einem HRT-Zyklus unterzogen, wurden die Proben genau 5 Tage nach Beginn der Progesteron-Supplementierung geplant. Um verschiedene Subtypen von NK-Zellen im End…

Discussion

Bei der Einnistung des Embryos handelt es sich um eine komplexe Wechselwirkung zwischen dem Embryo und der Gebärmutterschleimhaut. Der immunologische Status der Endometriumhomöostase spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Empfänglichkeit des Endometriums. Während der WOI sind NK-Zellen die vorherrschende Leukozytenpopulation im Endometrium. Etwa 90% der uNK-Zellen weisen eine hohe CD56-Expression auf, es fehlt jedoch an CD16. Eine untergeordnete Untergruppe von uNK-Ze…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die vorliegende Studie wurde vom Health and Medical Research Fund (10210956) unterstützt.

Materials

CD49a Novus Biologicals NBP2-76478 Primary antibodies
CD56 Leica NCL-L-CD56-504 Primary antibodies
CD16 abcam ab183354 Primary antibodies
CXCR4 R&D MAB172 Primary antibodies
Amplification diluent Akoya Biosciences FP1498 series Fluorophore dilution buffer
Antibody diluents Akoya Biosciences ARD1001EA Dilute the antibody
Citrate buffered solution, pH 6.0 /9.0(10x) Akoya Biosciences A6001/A9001 Antigen retrieval solution
inForm advanced image analysis software Akoya Biosciences inForm Tissue Finder Software 2.2.6 Data analysis software
Mantra Workstations Akoya Biosciences CLS140089 Spectral imaging
microwave Akoya Biosciences inverter Microwave stripping
TSA 520 Akoya Biosciences FP1487001K Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 620 Akoya Biosciences FP1495001K Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 650 Akoya Biosciences FP1496001K Suitable tyramide-based fluorescent reagents
TSA 570 Akoya Biosciences FP1488001K Suitable tyramide-based fluorescent reagents
Poly-L-lysine coated slides Fisher Technologies 120-550-15 Slides for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum Perkin Elmer ARH1001EA Secondary antibodies
Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium ThemoFisher Science 495802 Installation
Spectral DAPI Akoya Biosciences FP1490A Nucleic acid staining

Referenzen

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Chen, L., Chan, L. K. Y., Wong, S. C. Y., Li, J. J. X., Chung, J. P. W., Wang, C. C., Li, M., Zhang, T. Measurement of Four Uterine NK Cell Subtypes Using Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining in Women with Repeated Implantation Failure. J. Vis. Exp. (212), e67284, doi:10.3791/67284 (2024).

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