Summary

Enterische Gliakultur bei Pferden und Anwendung zur Untersuchung eines neuronalen Entzündungsmechanismus bei Pferdekoliken

Published: October 04, 2024
doi:

Summary

Enterische Gliazellen werden zunehmend für ihre Rolle bei der Darmhomöostase und bei Krankheitsprozessen, einschließlich postoperativer Komplikationen, anerkannt. Equidenpatienten, die sich von einer explorativen Notfall-Laparotomie erholen, leiden unter einem hohen Risiko für entzündliche postoperative Erkrankungen, was die Bedeutung der Etablierung einer wiederholbaren enterischen Glia-Primärzellkultur für die Studie unterstreicht.

Abstract

Entzündliche postoperative Erkrankungen der Pferdekoliken (akutes Abdomen) tragen nicht nur zu erhöhten Kundenkosten, Patientenbeschwerden und Krankenhausaufenthalten bei, sondern erweisen sich in vielen Fällen als lebensbedrohlich. Eine einzigartige Population von Darmzellen, enterische Gliazellen, wird zunehmend für ihre Rolle bei der Wahrnehmung des gastrointestinalen Milieus und der Kommunikation mit den umgebenden Zelltypen anerkannt. Wechselwirkungen zwischen enterischen Gliazellen und Darmepithelien können sich als entscheidend erweisen, um festzustellen, wie enterische Gliazellen bei Pferden die Schleimhautbarriere verändern können, um Entzündungen bei Gesundheit und Koliken zu modulieren.

Um diese Interaktion zu untersuchen, stellen wir eine Methode vor, bei der primäre enterische Gliakulturen von Pferden aus equinem Jejunum etabliert und die Kulturen entzündlichen Zuständen ausgesetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie bei Koliken vorhanden sind. Primäre enterische Gliakulturen wurden von erwachsenen Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit Koliken zu tun hatten, euthanasiert wurden. Darmzotten und Lamina propria wurden mikropräpariert, um die Submukosa freizulegen. Die isolierte Submukosa wurde 2-3 Stunden lang enzymatisch mit Kollagenase, Protease und Rinderserumalbumin verdaut. Als nächstes ergab der mechanische Aufschluss mit Zentrifugation, Pipettieren und Zellsieben (40-100 μm) ein Pellet, das für die Beschichtung auf 0,05 mg/ml-Poly-L-Lysin-beschichteten Wells bei einer Konzentration von ~400.000 Zellen/300 μl Medium verwendet wurde.

Nach der Konfluenz und der ersten Passage wurden die enterischen Gliazellen dann 24 Stunden lang rekombinantem IL-1β (0, 10, 25 ng) ausgesetzt. Um epithelial-gliale Wechselwirkungen zum Zeitpunkt der Koliken zu modellieren, wurde Medium, das entweder durch Kontrollglia oder behandelte enterische Gliazellen kontaminiert wurde, direkt zu konfluenten jejunalen Monoschichten von Pferden hinzugefügt, während der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) mit einer EndOhm-Kammer mit zwei Elektroden gemessen wurde. Diese Daten zeigen nur eine von vielen potenziell wirkungsvollen Anwendungen der enterischen Gliakultur von Pferden.

Introduction

Pferdekoliken sind die häufigste medizinische Beschwerde, die bei der Notfallkonsultationauftreten 1. Da bis zu 17 % der Pferde eine chirurgische Korrektur benötigen, sollten die Bemühungen zur Verbesserung der postoperativen Ergebnisse im Vordergrund der pferdemedizinischen Forschung stehen2. Derzeit haben postoperative Kolikpatienten ein hohes Risiko für mehrere lebensbedrohliche Erkrankungen, darunter Sepsis/endotoxämischer Schock (12,3 % der Patienten) und postoperativer Ileus (13,7 % der Patienten)3. Trotz Fortschritten bei der Behandlung postoperativer Komplikationen besteht nach wie vor ein Bedarf an fortschrittlichen Behandlungen zur Vorbeugung oder Behandlung dieser Erkrankungen.

Neuere Forschungen haben den lokalen und systemischen Entzündungsstatus von Kolikpatienten hervorgehoben4. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass proinflammatorische Proteine wie der Tumornekrosefaktor (TNF) alpha, Interleukin 1β (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6) und das Monozyten-Chemoattractant-Protein-1 in der Kolik-Darmschleimhaut im Vergleich zu normalem Darmgewebe signifikant erhöht sind4. Aus systemischer Sicht konnte gezeigt werden, dass ein erhöhter TNF-alpha-Spiegel im Darmgewebe mit einem erhöhten Risiko für einen postoperativen nasogastrischen Reflux von mehr als 2 l korreliert, ein allgemeines Maß für die postoperative Motilitätsdystilität4. Es ist auch bekannt, dass die Verabreichung von Interleukin, IL-1β und TNF alpha in der Lage ist, klinische Anzeichen eines septischen Schocks zu induzieren5.

Eine mögliche Erklärung für den entzündlichen Status von Kolik-Darmgewebe und dessen Zusammenhang mit postoperativen Komplikationen ist die Darmepithelbarriere. Im Gesundheitswesen stellen die Tight-Junction-Komplexe, die die einzelne Schicht des Säulenepithels verbinden, die den Darmtrakt auskleidet, eine funktionelle Barriere dar, um zu verhindern, dass der Luminalgehalt und seine bakteriellen Bestandteile den submukkösen Raum und den Blutkreislauf erreichen. Die Dehnung und Schädigung durch kolikassoziierte Darmverschlüsse und Darmmanipulationen während der Operation können jedoch diese Darmbarrierefunktion stören.

In Bezug auf die funktionellen Komponenten der Darmwand als Ganzes hat sich gezeigt, dass das submuköse enterische Glianetzwerk innerhalb des enterischen Nervensystems entscheidend für die pathophysiologische Entwicklung postoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit Entzündungswegen ist und ein spezifisches therapeutisches Ziel darstellen kann 6,7,8,9 . Enterische Gliazellen sind nicht nur im gesamten Magen-Darm-Trakt vorhanden, sondern fungieren auch als Sensoren der Darmumgebung, beeinflussen die Signalübertragung mit zahlreichen Zelltypen der Darmwand und regulieren direkt die Darmbarriere6. Es ist daher vertretbar anzunehmen, dass diese potenten Sensoren des Darms durch Verletzungen und Entzündungen aktiviert werden und eine akute Reaktion wie Veränderungen der Barrierepermeabilität hervorrufen könnten.

Diese Studie ist die erste, die die Kultur der enterischen Gliazellen von Pferden und insbesondere die Rolle entzündlicher enterischer Gliazellen bei Pferden für die Funktion der Darmbarriere beschreibt. In diesem Artikel stellen wir Methoden zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen bei Pferden und ihre Reaktion auf die Exposition gegenüber inflammatorischem IL-1β vor, die Bewertung der Wirkung von enterischen Gliaprodukten nach IL-1β-Exposition auf die Permeabilität von equinen Enterozyten-Monoschichten und eine mögliche Blockade durch die Anwendung von equinem Serum.

Protocol

Enterale Glia-Primärkulturen von Pferden wurden von drei Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit dieser Studie zu tun hatten, human euthanasiert und mit einer Überdosis eines Barbiturats eingeschläfert worden waren. Bei den für die Kulturstudien ausgewählten Pferden handelte es sich um erwachsene Pferde ohne Vorgeschichte von Magen-Darm-Erkrankungen. 1. Submuköse enterische Glia-Primärkultur bei Pferden Züchten Sie…

Representative Results

Die Mikrodissektion des equinen Jejunums in die submuköse Schicht (Abbildung 1) mit weiterem enzymatischem und mechanischem Verdau könnte lebensfähige Zellkulturen der enterischen Gliazellen des Pferdes erzeugen. Die Zellen zeigten einen Pleomorphismus mit einer Dominanz spindelförmiger Zellen, die mit den enterischen Gliazellen anderer Spezies übereinstimmt (Abbildung 2A). Die Kulturen waren positiv für den selektiven Gli…

Discussion

Das Ziel dieser Studie war es, eine wiederholbare Methode zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen von Pferden zu entwickeln und ihre Anwendung zur Modellierung von Epithel-Glia-Interaktionen zum Zeitpunkt der Koliken zu demonstrieren. Die Isolierung und Kultur enterischer Gliazellen, die beim Pferd neu ist, hat sich als vorteilhaft für das Verständnis der Darmkrankheitswege in Schweine- und Nagetiermodellen sowie beim Menschen erwiesen</sup…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken der Morris Animal Foundation für die Finanzierung dieses Projekts.

Materials

1 M HEPES buffer Gibco 15630-080
10 mM HEPES Life Technologies 15630-106
2 mM GlutaMAX Life Technologies 25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol Invitrogen D3571
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody Abcam 7817
Amphotericin B Sigma AA9529 4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x Gibco 15240-096
B27 Gibco 12587010
Bovine Serum Albumin Sigma AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution Sigma A3311
CaCL2 ACROS Organiics 206791000 Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase Sigma 9891
DMEM-F12 media Thermo Fisher 11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen 21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber World Precision Instruments EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement World Precision Instruments EVM-MT-03-01
G5 Gibco 17503012
Gentamicin solution Sigma G1272 Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody Abcam 4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen 28175
IL-1β ELISA Thermo Fisher ESIL1B
KCl Thermo Fisher P330-500 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution Corning 25-00-Cl
Matrigel BD Bioscience 354277
MgCl2 Thermo Fisher M33-500 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2 Gibco 17502048
Na2HPO4 Thermo Fisher BP332-1 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl Thermo Fisher S271-10 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4 Thermo Fisher BP329-500 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3 Thermo Fisher S637-212 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution Gemini 400-109
Poly-L-lysine Sigma P2636 0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software GraphPad
Protease Sigma P4630
Sodium bicarbonate solution Sigma S8761 7.5% stock solution

Referenzen

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69 (2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422 (2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108 (2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345 (2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

Diesen Artikel zitieren
Hellstrom, E., McKinney-Aguirre, C., Gonzalez, L., Ziegler, A., Blikslager, A. Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic. J. Vis. Exp. (212), e67244, doi:10.3791/67244 (2024).

View Video