Enterische Gliazellen werden zunehmend für ihre Rolle bei der Darmhomöostase und bei Krankheitsprozessen, einschließlich postoperativer Komplikationen, anerkannt. Equidenpatienten, die sich von einer explorativen Notfall-Laparotomie erholen, leiden unter einem hohen Risiko für entzündliche postoperative Erkrankungen, was die Bedeutung der Etablierung einer wiederholbaren enterischen Glia-Primärzellkultur für die Studie unterstreicht.
Entzündliche postoperative Erkrankungen der Pferdekoliken (akutes Abdomen) tragen nicht nur zu erhöhten Kundenkosten, Patientenbeschwerden und Krankenhausaufenthalten bei, sondern erweisen sich in vielen Fällen als lebensbedrohlich. Eine einzigartige Population von Darmzellen, enterische Gliazellen, wird zunehmend für ihre Rolle bei der Wahrnehmung des gastrointestinalen Milieus und der Kommunikation mit den umgebenden Zelltypen anerkannt. Wechselwirkungen zwischen enterischen Gliazellen und Darmepithelien können sich als entscheidend erweisen, um festzustellen, wie enterische Gliazellen bei Pferden die Schleimhautbarriere verändern können, um Entzündungen bei Gesundheit und Koliken zu modulieren.
Um diese Interaktion zu untersuchen, stellen wir eine Methode vor, bei der primäre enterische Gliakulturen von Pferden aus equinem Jejunum etabliert und die Kulturen entzündlichen Zuständen ausgesetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie bei Koliken vorhanden sind. Primäre enterische Gliakulturen wurden von erwachsenen Pferden gewonnen, die aus Gründen, die nichts mit Koliken zu tun hatten, euthanasiert wurden. Darmzotten und Lamina propria wurden mikropräpariert, um die Submukosa freizulegen. Die isolierte Submukosa wurde 2-3 Stunden lang enzymatisch mit Kollagenase, Protease und Rinderserumalbumin verdaut. Als nächstes ergab der mechanische Aufschluss mit Zentrifugation, Pipettieren und Zellsieben (40-100 μm) ein Pellet, das für die Beschichtung auf 0,05 mg/ml-Poly-L-Lysin-beschichteten Wells bei einer Konzentration von ~400.000 Zellen/300 μl Medium verwendet wurde.
Nach der Konfluenz und der ersten Passage wurden die enterischen Gliazellen dann 24 Stunden lang rekombinantem IL-1β (0, 10, 25 ng) ausgesetzt. Um epithelial-gliale Wechselwirkungen zum Zeitpunkt der Koliken zu modellieren, wurde Medium, das entweder durch Kontrollglia oder behandelte enterische Gliazellen kontaminiert wurde, direkt zu konfluenten jejunalen Monoschichten von Pferden hinzugefügt, während der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) mit einer EndOhm-Kammer mit zwei Elektroden gemessen wurde. Diese Daten zeigen nur eine von vielen potenziell wirkungsvollen Anwendungen der enterischen Gliakultur von Pferden.
Pferdekoliken sind die häufigste medizinische Beschwerde, die bei der Notfallkonsultationauftreten 1. Da bis zu 17 % der Pferde eine chirurgische Korrektur benötigen, sollten die Bemühungen zur Verbesserung der postoperativen Ergebnisse im Vordergrund der pferdemedizinischen Forschung stehen2. Derzeit haben postoperative Kolikpatienten ein hohes Risiko für mehrere lebensbedrohliche Erkrankungen, darunter Sepsis/endotoxämischer Schock (12,3 % der Patienten) und postoperativer Ileus (13,7 % der Patienten)3. Trotz Fortschritten bei der Behandlung postoperativer Komplikationen besteht nach wie vor ein Bedarf an fortschrittlichen Behandlungen zur Vorbeugung oder Behandlung dieser Erkrankungen.
Neuere Forschungen haben den lokalen und systemischen Entzündungsstatus von Kolikpatienten hervorgehoben4. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass proinflammatorische Proteine wie der Tumornekrosefaktor (TNF) alpha, Interleukin 1β (IL-1β), Interleukin 6 (IL-6) und das Monozyten-Chemoattractant-Protein-1 in der Kolik-Darmschleimhaut im Vergleich zu normalem Darmgewebe signifikant erhöht sind4. Aus systemischer Sicht konnte gezeigt werden, dass ein erhöhter TNF-alpha-Spiegel im Darmgewebe mit einem erhöhten Risiko für einen postoperativen nasogastrischen Reflux von mehr als 2 l korreliert, ein allgemeines Maß für die postoperative Motilitätsdystilität4. Es ist auch bekannt, dass die Verabreichung von Interleukin, IL-1β und TNF alpha in der Lage ist, klinische Anzeichen eines septischen Schocks zu induzieren5.
Eine mögliche Erklärung für den entzündlichen Status von Kolik-Darmgewebe und dessen Zusammenhang mit postoperativen Komplikationen ist die Darmepithelbarriere. Im Gesundheitswesen stellen die Tight-Junction-Komplexe, die die einzelne Schicht des Säulenepithels verbinden, die den Darmtrakt auskleidet, eine funktionelle Barriere dar, um zu verhindern, dass der Luminalgehalt und seine bakteriellen Bestandteile den submukkösen Raum und den Blutkreislauf erreichen. Die Dehnung und Schädigung durch kolikassoziierte Darmverschlüsse und Darmmanipulationen während der Operation können jedoch diese Darmbarrierefunktion stören.
In Bezug auf die funktionellen Komponenten der Darmwand als Ganzes hat sich gezeigt, dass das submuköse enterische Glianetzwerk innerhalb des enterischen Nervensystems entscheidend für die pathophysiologische Entwicklung postoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit Entzündungswegen ist und ein spezifisches therapeutisches Ziel darstellen kann 6,7,8,9 . Enterische Gliazellen sind nicht nur im gesamten Magen-Darm-Trakt vorhanden, sondern fungieren auch als Sensoren der Darmumgebung, beeinflussen die Signalübertragung mit zahlreichen Zelltypen der Darmwand und regulieren direkt die Darmbarriere6. Es ist daher vertretbar anzunehmen, dass diese potenten Sensoren des Darms durch Verletzungen und Entzündungen aktiviert werden und eine akute Reaktion wie Veränderungen der Barrierepermeabilität hervorrufen könnten.
Diese Studie ist die erste, die die Kultur der enterischen Gliazellen von Pferden und insbesondere die Rolle entzündlicher enterischer Gliazellen bei Pferden für die Funktion der Darmbarriere beschreibt. In diesem Artikel stellen wir Methoden zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen bei Pferden und ihre Reaktion auf die Exposition gegenüber inflammatorischem IL-1β vor, die Bewertung der Wirkung von enterischen Gliaprodukten nach IL-1β-Exposition auf die Permeabilität von equinen Enterozyten-Monoschichten und eine mögliche Blockade durch die Anwendung von equinem Serum.
Das Ziel dieser Studie war es, eine wiederholbare Methode zur Primärkultur von submukösen enterischen Gliazellen von Pferden zu entwickeln und ihre Anwendung zur Modellierung von Epithel-Glia-Interaktionen zum Zeitpunkt der Koliken zu demonstrieren. Die Isolierung und Kultur enterischer Gliazellen, die beim Pferd neu ist, hat sich als vorteilhaft für das Verständnis der Darmkrankheitswege in Schweine- und Nagetiermodellen sowie beim Menschen erwiesen</sup…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken der Morris Animal Foundation für die Finanzierung dieses Projekts.
1 M HEPES buffer | Gibco | 15630-080 | |
10 mM HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
2 mM GlutaMAX | Life Technologies | 25050-061 | |
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol | Invitrogen | D3571 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
Alpha smooth muscle actin antibody | Abcam | 7817 | |
Amphotericin B | Sigma | AA9529 | 4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL |
Anti-Antimicotic 1x | Gibco | 15240-096 | |
B27 | Gibco | 12587010 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | AA3311 | |
BSA 50 mg/mL stock solution | Sigma | A3311 | |
CaCL2 | ACROS Organiics | 206791000 | Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”. |
Collagenase | Sigma | 9891 | |
DMEM-F12 media | Thermo Fisher | 11320033 | |
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Invitrogen | 21207 | |
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber | World Precision Instruments | EVM-EL-03-01 | |
EVOM Manual for TEER Measurement | World Precision Instruments | EVM-MT-03-01 | |
G5 | Gibco | 17503012 | |
Gentamicin solution | Sigma | G1272 | Final concentration 20 µg/mL |
GFAP antibody | Abcam | 4674 | |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 28175 | |
IL-1β ELISA | Thermo Fisher | ESIL1B | |
KCl | Thermo Fisher | P330-500 | Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”. |
L-glutamine solution | Corning | 25-00-Cl | |
Matrigel | BD Bioscience | 354277 | |
MgCl2 | Thermo Fisher | M33-500 | Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”. |
N2 | Gibco | 17502048 | |
Na2HPO4 | Thermo Fisher | BP332-1 | Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”. |
NaCl | Thermo Fisher | S271-10 | Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”. |
NaH2PO4 | Thermo Fisher | BP329-500 | Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”. |
NaHCO3 | Thermo Fisher | S637-212 | Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2. Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”. |
Pen/Strep solution | Gemini | 400-109 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | 0.5 mg/mL in 1x borate buffer |
Prism software | GraphPad | ||
Protease | Sigma | P4630 | |
Sodium bicarbonate solution | Sigma | S8761 | 7.5% stock solution |
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