Bestimmung der Serumstabilität des humanen Adenosin-Desaminase-1-Enzyms

1. Inkubation im Serum Bereiten Sie eine 10-fache Brühe HsADA1 in 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) in einer Endkonzentration von 10 μM vor. Tauen Sie ein 15-ml-Aliquot des gepoolten Humanserums auf und erwärmen Sie es auf 37 °C. Erwärmen Sie ein 50 mL aliquot von 1x PBS auf 37 °C. Bereiten Sie die Enzym-Serum-Inkubationsgemische vor, indem Sie 100 μl des 10x HsADA1-Stammes zu 900 μl gepooltem Humanserum in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung hinzufügen, das als Enzym + Serum-Mischung bezeichnet wird. Geben Sie in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung 100 μl des 10x HsADA1-Stammes zu 900 μl 1x PBS zum Vergleich mit einer Nicht-Serumkontrolle, die als Enzym + 1x PBS-Mischung bezeichnet wird. Die Endkonzentration von HsADA1 in jedem Gemisch beträgt 1 μM. Bereiten Sie eine zusätzliche Kontrolle in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung vor, das aus 100 μl 1x PBS gemischt mit 900 μl gepooltem humanem Serum besteht. Dies dient als Nicht-Enzym-Kontrolle für die Enzym + Serum-Mischung. Machen Sie zusätzlich eine Kontrolle, die aus 1 mL 1x PBS besteht. Dies dient als Nicht-Enzym-Kontrolle für das Enzym + 1x PBS-Gemisch. Aliquotieren Sie 100 μl jedes Gemisches aus Schritt 1.2 in separate Röhrchen mit geringer Bindung und verdünnen Sie es 1:1 mit 100 μl 30 % (v/v) Glycerin in 1x PBS. Mit flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80 °C lagern. Diese Proben sind der Zeitpunkt von Tag 0, und die Konzentration von HsADA1 in ihnen beträgt 500 nM. Dieser Schritt wird für die Nicht-Enzym-Kontrollmischungen aus Nummer 1.3 wiederholt. Verschließen Sie alle Enzyme und Kontrollgemische mit einer transparenten Folie und geben Sie sie in einen 37 °C heißen Inkubator. Nach 24 h aliquotieren Sie 100 μl jeder inkubierten Probe und verdünnen sie 1:1 mit 100 μl 30 % (v/v) Glycerin in 1x PBS. Mit flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80 °C lagern. Bei diesen Beispielen handelt es sich um den Zeitpunkt von Tag 1. Alle Enzym- und Kontrollgemische wieder in den 37 °C-Inkubator geben. Wiederholen Sie diesen Schritt bei 72 h und 120 h.HINWEIS: Aliquotierte Proben müssen nicht unbedingt schockgefroren werden. Alternativ kann der Benutzer den Mikrotiterplatten-basierten Assay unmittelbar nach der Entnahme jeder Probe durchführen, obwohl jedes Mal, wenn eine Probe getestet wird, frische Standardkurven und Adenosin-Substratbestände vorbereitet werden sollten. 2. Mikrotiterplatten-basierter Assay Bereiten Sie den Mikroplatten-Reader vor, indem Sie ein kinetisches Leseprotokoll einrichten (Abbildung 2), um die Absorption bei 260 nm mit dem kürzesten Leseintervall für 30 Minuten zu messen und den Reader auf einen Sollwert von 37 °C vorzuheizen. Tauen Sie alle gesammelten Proben auf Eis auf. Jede aufgetaute Probe wird 1:10 mit 1x PBS verdünnt, das auf 37 °C als Verdünnungsmittel in Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung vorgewärmt wird. Die neue HsADA1-Konzentration in diesen Proben wird 50 nM betragen. Führen Sie eine 10-fache Verdünnung in 1x PBS auch aus der Nicht-Enzym-Serum-Kontrollprobe durch. Bereiten Sie zusätzlich eine 5 mM Adenosin-Brühe vor, indem Sie 66,8 mg Adenosin zu 50 mL 1x PBS hinzufügen. Bereiten Sie eine 250 μM Verdünnung von Adenosin vor, indem Sie 400 μl des Adenosinstocks zu 7.600 μl 1x PBS hinzufügen und in einem Inkubator auf 37 °C vorwärmen. Zu einer UV-kompatiblen 96-Well-Mikroplatte fügen Sie 160 μl der 250 μM Adenosinverdünnung und 40 μl jeder verdünnten Proteinprobe in dreifacher Ausfertigung hinzu, um ein Gesamtvolumen von 200 μl zu erhalten. Dies ergibt eine endgültige Adenosinkonzentration von 200 μM und eine endgültige Enzymkonzentration von 10 nM. Wiederholen Sie die Verdünnung für die Kontrollproben, indem Sie 40 μl des verdünnten Serums oder 1x PBS-Kontrollen und 160 μl der 250 μM Adenosinverdünnung in dreifacher Ausfertigung hinzufügen. Dies ergibt auch eine endgültige Adenosinkonzentration von 200 μM, jedoch ohne Enzym.HINWEIS: Es kann von Vorteil sein, zuerst alle verdünnten Enzym- und Kontrollproben einzeln in die Mikroplatte zu geben und dann das Adenosinsubstrat mit einer 12-Kanal-Mikropipette hinzuzufügen, um die Gesamtladezeit zu verkürzen. Zusätzlich müssen in diesem Schritt UV-transparente Platten verwendet werden, um zu verhindern, dass die Platte selbst das gemessene Absorptionssignal verfälscht. Messen Sie die Extinktion jeder Vertiefung bei 260 nm für 30 min bei 37 °C. Sobald dies erledigt ist, exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse in eine Tabelle. 3. Analyse der Daten von Mikroplatten-Readern Bestimmen Sie die Steigung des linearen Bereichs der Absorptionsdaten als Funktion der Zeit für die ersten Minuten der Mikroplattendaten. Bei den serumverdünnten Proben entsprach dies den ersten ~120 s. Bei den 1x PBS-verdünnten Proben entsprach dies den ersten ~270 s. Diese Steigung der degressiven Absorptionswerte hat einen negativen numerischen Wert und hat Einheiten für die Änderung der Absorptionseinheiten pro Sekunde (ΔA260/s). Subtrahieren Sie die Steigung der Negativkontrolle, die aus gepooltem Humanserum besteht, von der Steigung der Enzym + Serumdaten. Führen Sie den gleichen Vorgang mit den Enzym + 1x PBS-Mischungen durch, indem Sie die Steigung der 1x PBS-Kontrolle subtrahieren. Normalisieren Sie alle angepassten Steigungen auf die ursprüngliche Steigung bei t=0 h, um den Anteil der verbleibenden Aktivität unter Verwendung von Gleichung 1 zu erhalten.Gleichung 1 Plotten Sie den Anteil der verbleibenden Aktivität über die Zeit.