Summary

Visualisierung der DNA-Schadensantwort in Purkinje-Zellen mit Hilfe von zerebellären organotypischen Kulturen

Published: December 27, 2024
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Summary

Kleinhirn-Purkinje-Zellen (PCs) reagieren besonders empfindlich auf Defizite in der DNA-Schadensreaktion. Es wird ein Protokoll zur visuellen Bewertung der Dynamik der PC-Reaktion auf DNA-Schäden vorgestellt, das die Färbung proteingebundener Poly(ADP-Ribose)-Ketten in zerebellären organotypischen Kulturen beinhaltet.

Abstract

Kleinhirn-Purkinje-Zellen (PCs) weisen ein einzigartiges Zusammenspiel aus hohen Stoffwechselraten, spezifischer Chromatinarchitektur und umfangreicher Transkriptionsaktivität auf, was sie besonders anfällig für DNA-Schäden macht. Dies erfordert eine effiziente DNA-Schadensantwort (DDR), um eine Kleinhirndegeneration zu verhindern, die oft durch PC-Dysfunktion oder -Verlust ausgelöst wird. Ein bemerkenswertes Beispiel ist das Genominstabilitätssyndrom, Ataxie-Teleangiektasien (A-T), das durch fortschreitende PC-Depletion und Kleinhirnverschlechterung gekennzeichnet ist. Die Untersuchung der DDR-Mechanismen bei PCs ist von entscheidender Bedeutung, um die Wege aufzuklären, die zu ihrer Degeneration bei solchen Erkrankungen führen. Die Komplexität der Isolierung und Kultivierung von PCs in vitro hat die Forschungsbemühungen jedoch lange Zeit behindert. Murine zerebelläre organotypische (Schnitt-)Kulturen bieten eine praktikable Alternative, da sie die in vivo Gewebeumgebung genau nachahmen. Dieses Modell ist jedoch auf DDR-Indikatoren beschränkt, die für mikroskopische Bildgebung zugänglich sind. Wir haben das organotypische Kulturprotokoll verfeinert und gezeigt, dass die Fluoreszenzbildgebung von proteingebundenen Poly(ADP-Ribose) (PAR)-Ketten, einem schnellen und frühen DDR-Indikator, die DDR-Dynamik in PCs innerhalb dieser Kulturen als Reaktion auf genotoxischen Stress effektiv aufdeckt.

Introduction

Die Integrität der zellulären DNA ist ständig durch DNA-schädigende Wirkstoffe bedroht, vor allem durch metabolische Nebenprodukte wie reaktive Sauerstoffspezies, die täglich Zehntausende von DNA-Läsionen pro Zelle verursachen1. Die dauerhafte Aufrechterhaltung der Genomstabilität ist für die zelluläre Homöostase essentiell 2,3. Der Eckpfeiler dieser Aufrechterhaltung ist die DNA-Schadensantwort (DDR) – ein kompliziertes, geschichtetes Signalnetzwerk, das spezifische DNA-Reparaturwege initiiert und gleichzeitig viele andere zelluläre Prozesse sorgfältig anpasst 4,5. Defizite in der DDR manifestieren sich häufig als “Genominstabilitätssyndrome”, die durch chromosomale Instabilität, fortschreitende Gewebeverschlechterung, beeinträchtigtes Wachstum oder Entwicklung, eine Veranlagung für Krebs und eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber bestimmten DNA-schädigenden Wirkstoffen gekennzeichnetsind 6,7,8,9. Insbesondere die Neurodegeneration, die häufig eine Kleinhirnatrophie einschließt, ist ein charakteristisches Merkmal vieler Genominstabilitätssyndrome 7,10,11,12.

Die autosomal-rezessive Störung, die Ataxie-Teleangiektasie (A-T), ist ein gut dokumentiertes Beispiel für eine Genominstabilitätsstörung 13,14,15. Dieser Zustand entsteht durch Nullmutationen im ATM-GEN (A-T, mutiert), das für die Kodierung der zentralen Proteinkinase ATM verantwortlich ist, die in erster Linie als DDR-Mobilisierer als Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) bekannt ist16,17. A-T manifestiert sich als Multisystemstörung, die überwiegend durch eine fortschreitende Kleinhirndegeneration gekennzeichnet ist, die zu akuten motorischen Beeinträchtigungen, Immunschwäche, Gonadenatrophie, Krebsprädisposition und extremer Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung führt. Kultivierte Zellen von Individuen mit A-T zeigen eine chromosomale Instabilität und eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber genotoxischen Wirkstoffen, insbesondere solchen, die DSBs verursachen 15,18,19. Wichtig ist, dass ATM auch eine Rolle bei der Reparatur anderer DNA-Läsionen spielt, was seine breite Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität unterstreicht 20,21,22.

Trotz gründlicher Forschung über die zahlreichen Rollen von ATM bleibt der spezifische Mechanismus, der zur Kleinhirndegeneration bei A-T führt, ein Thema aktiver Debatten, wobei verschiedene Modelle vorgeschlagen werden, um diesen Prozess aufzuklären 23,24,25,26,27,28,29,30. Unser Modell28 deutet darauf hin, dass die Kleinhirndegeneration bei AT-Patienten mit der Dysfunktion und dem letztendlichen Verlust von Purkinje-Zellen (PCs) beginnt. In Anbetracht der entscheidenden Rolle von ATM bei der Erhaltung der Genomstabilität angesichts anhaltender DNA-Schäden sind PCs besonders anfällig für das Fehlen von ATM. Wir führen diese Anfälligkeit auf die Kombination aus hoher metabolischer Aktivität, ausgeprägter Chromatinstruktur und umfangreicher transkriptioneller Aktivität zurück. Letztendlich wird vermutet, dass der Verlust der PC-Funktion und damit ihre Degeneration auf die stochastische, funktionelle Inaktivierung von Genen zurückzuführen ist, eine Folge der Produktion defekter Transkripte28.

Die Erforschung der PC-Biologie im Labor wird durch Herausforderungen bei der Kultivierung isolierter PCs behindert, da diese Zellen für ihr Überleben und ihre Funktion stark auf ihr natürliches Milieu und benachbarte Zellen angewiesen sind, was sie mit dem dissoziierten Kulturwachstum inkompatibel macht. Nichtsdestotrotz können PCs in Gewebeschnittkulturen über längere Zeiträume lebensfähig bleiben. Zerebelläre organotypische Kulturen, bei denen es sich um Gewebeschnitte handelt, die typischerweise aus Nagetier-Cerebella gewonnen werden, erhalten die strukturelle Organisation des Gewebes aufrecht und unterstützen verschiedene experimentelle Manipulationen, die denen entsprechen, die mit kultivierten Zellen möglich sind. Daher ermöglichen diese Kulturen Kleinhirnuntersuchungen in einer kontrollierten Umgebung 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Insbesondere im Zusammenhang mit A-T haben sich murine zerebelläre organotypische Kulturen als maßgeblich für die Erforschung der DDR bei Atm-defizienten PCserwiesen 40,41,42,43. Während Atm-defiziente Mäuse nur einen subtilen Kleinhirn-Phänotypaufweisen 44,45,46,47, vermutlich aufgrund von Unterschieden zwischen der Kleinhirnphysiologie von Mensch und Maus, wird davon ausgegangen, dass die Rolle von ATM bei diesen Spezies weitgehend konserviert ist. Diese Annahme wird durch unsere Beobachtungen gestützt, dass die defiziente Reaktion auf DNA-DSBs in Atm-/– murinen PCs mit der übereinstimmt, die in anderen murinen und humanen ATM/Atm-defizienten Zelltypen beobachtet wurde 40,41,42,43.

Eine Einschränkung bei der Analyse von PC-Reaktionen auf verschiedene Reize oder Stressfaktoren in organotypischen Kulturen ist die Notwendigkeit, sich bei der Auslesung auf mikroskopische Bildgebung zu verlassen. Die DDR wird in der Regel mit biochemischen Massenauslesungen untersucht, obwohl auch gängige Immunfluoreszenzmarker verwendet werden, wie z. B. die Verfolgung der Dynamik der Bildung und Auflösung von Kernherden des phosphorylierten Histons H2AX (γH2AX) und des 53BP1-Proteins, die als Indikatoren für DSBs gelten48,49. Ein breiteres Maß ist die Fluoreszenzbildgebung der Poly(ADP-Ribose) (PAR)-Kettenbildung auf Proteinen, eine schnelle und robuste frühe DNA-Schadensreaktion, insbesondere auf Strangbrüche 7,50. Wir modifizierten das Protokoll von Komulainen et al.51 für die PAR-Färbung in zerebellären organotypischen Kulturen. Wir beobachteten eine ausgeprägte PAR-Antwort in den großen Zellkernen von PCs. Hier vorgestellt wird unser verfeinertes Protokoll zur Etablierung von zerebellären organotypischen Kulturen von Mäusen und zur Visualisierung der PAR-Antwort unter genotoxischem Stress.

Protocol

In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu Materialien, Geräten und Antikörpern. Tierversuche wurden nach der Genehmigung nach den ethischen Richtlinien der Ethikkommission der Universität Tel Aviv angewendet. Das Verfahren wird an 10 Tage alten Mäusewelpen durchgeführt, unabhängig von ihrem Geschlecht. Bei Bedarf wird die Genotypisierung am Vortag mit einer Schwanzbiopsie und Standardmethoden durchgeführt. Lösungen sind steril und werden bei 4 °C gelager…

Representative Results

Abbildung 1 veranschaulicht das allgemeine Erscheinungsbild der kleinhirnorganischen Kulturen. Die obere Reihe in Abbildung 1A zeigt die Kleinhirnfoliation, die in Kultur erhalten bleibt, während die untere Reihe die für Calbindin D-28k gefärbten PCs (grün) und die für NeuN gefärbten neuronalen Kerne (rot) zeigt. In Abbildung 1B sind die Astrozyten in den PCs (rot) mit GFAP (grün) gefärbt, e…

Discussion

Allgemeine Bemerkungen
Der große Vorteil des organotypischen Kultursystems besteht darin, dass es Studien mit dem Kleinhirnrindengewebe ermöglicht und seine strukturelle Organisation für mehrere Wochen in der Kulturschale bewahrt. Dieses System ist nützlich für die Durchführung eingehender morphologischer Analysen von Purkinje-Zellen (PCs), einschließlich detaillierter Untersuchungen von dendritischen Dornen und ultrastrukturellen Merkmalen 52,53,54,55,56,57,58…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeit in unserem Labor wird von der Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation und der Israeli Association for Fighting the A-T Disease unterstützt.

Materials

Reagent and Equipment
150 x 30 cm Petri dish Corning Inc. 3261
35 x 10 mm Petri dish Corning Inc. 3294
Acetone Invitrogen 25030081
Acetone Sigma-Aldrich 270725-1L
Adhesive microscope slides Marienfeld 48187 76 x 26 x 1 mm
Blades for chopper TED PELLA Model TC752-1  Style Razor Blades
BME GIBCO 41010-026 500ml.  No L-Glut
Cell culture inserts Millipore PICM0RG50
D-Glucose Biological Indo. 02-015-1A
HBSS w/o phenol red Sigma-Aldrich H-1138-500L No Ca+,No Mg+
HBSS with phenol red Sartorius 02-015-1A
Horse serum  GIBCO 26050088 heat inactivated
Iris forceps CellPath GZX-0100-00A 130mm blunt serrated
Iris spatula F.S.T 10092-12
L-Glutamine (200 mM) Gibco 41010026
Methanol Sigma-Aldrich 322412-1L
Methanol  Sigma-Aldrich G5767
Microscope Olympus
Mounting Medium without GRIGENE. Ltd, Israel K239320A
Paraquat Sigma-Aldrich 856177-250MG Paraquat dichloride (Methyl viologen)
PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor Tocris Bioscience, United Kingdom PDD 00017273 light sensitive 
Phosphate buffer Biological Indo. 02-018-1A
Scissors, skin-tissue
Six-well plates Corning incorporated CLS3516
Spare Chopping Discs  TED PELLA Model 10180-01
Tissue chopper McIlwain Model TC752 10180-220
Tweezers, pointed
Urinary cups
Antibodies
Alexa fluor 488 donkey anti Rabbit IgG  
Invitrogen
A21206 1:500; secondary ab; Secondary dilution buffer;  Incubation for 2 h at room temperature
Anti glial fibrillary acidic protien Milliphore MAB3402 1:1500; primary ab; blocking; Host:mouse
Anti-calbindin-D-28K Swant  CB300 1:2000; primary ab; blocking; host: rabbit 
Anti-calbindin-D-28K Swant CB-38a 1:2000; primary ab; blocking 
Anti-pan-ADP-ribose reagent Milliphore MABE1016 1:800; primary ab; blocking; incubation for 2 h at room temperature
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) Cell signaling 4084 1:1000; secondary dilution buffer; incubation for 20 min at room temperature

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Naor, S., Ziv, Y., Shiloh, Y. Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures. J. Vis. Exp. (214), e67167, doi:10.3791/67167 (2024).

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