Использование анализа теплового сдвига для зондирования связывания субстрата с селенопротеином O

Большая часть протеома человека остается плохо охарактеризованной. «Эффект уличного фонаря», описанный Данхэмом и Кустатшером и др., относится к явлению, при котором широко исследованные белки получают больше внимания, оставляя малоизученные белки незамеченными ^1,2. Факторы, способствующие этому эффекту, включают биологическую важность и актуальность определенных белков для заболевания. Более того, предварительные исследования, которые предлагают фундаментальные знания, а также наличие инструментов для функционального анализа, еще больше стимулируют исследования хорошо изученных белков ^1,2. Такие проекты, как Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium и Enzyme Function Initiative, направлены на характеристику малоизученных белков с использованием структурной и функциональной протеомики ^2,3,4. Дополнительным подходом к идентификации молекулярных функций недостаточно изученных белков является изучение взаимодействий этих белков с малыми молекулами для получения ценной информации о регуляции и специфичности субстрата.

Связывание малых молекул может повысить термическую стабильность белка⁵. Это явление, известное как индуцированная лигандом конформационная стабилизация, часто приводит к увеличению температуры плавления белка, что дает измеримое указание на связывание лиганда⁶. Термическая стабильность белка может быть измерена с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF), также известной как термофтор, или анализа теплового сдвига (TSA)7,8,9,10. При АСП образец белка подвергают повышению температуры в присутствии экологически чувствительного красителя⁶. По мере того, как белок разворачивается и денатурируется, краситель связывается с обнаженными гидрофобными областями белка и излучает флуоресценцию. Внешние флуоресцентные красители, или экологически чувствительные красители, не имеют собственной флуоресценции и вместо этого флуоресцируют при взаимодействии со своей целевой молекулой ^9,11,12. Наиболее часто используемый краситель, SYPRO Orange, обладает рядом преимуществ, таких как повышенная стабильность и минимальная фоновая флуоресценция ^8,9,12. Примечательно, что SYPRO Orange совместим с системами полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР), учитывая его длины волн возбуждения и излучения около 470 нм и 570 нм соответственно. Эта уникальная функция позволяет проводить высокопроизводительные, точные и чувствительные измерения, совместимые с системами обнаружения флуоресценции, обычно используемыми в системах ОТ-ПЦР⁸.

TSA является универсальным инструментом для исследования взаимодействия белков с потенциальными кофакторами или лекарственными препаратами, а также для определения стабилизирующих условий для кристаллографии. Некоторые из его преимуществ по сравнению с другими методами грохочения заключаются в относительной простоте настройки и высокой производительности при использовании 96- или 384-луночных планшетов 13,14,15. Разработка этого метода стала преобразующим для исследований по открытию лекарств, обеспечивая удобство и позволяя изучать различные добавки, такие как ионы, лиганды и лекарства ^6,16. Более того, адаптивность TSA побудила ученых расширить его применение, облегчая измерение аффинностей связывания наряду со скрининговыми анализами^17,18. TSA является эффективным инструментом в исследованиях структурной биологии для выявления условий, способствующих стабилизации белка, представляющего интерес для кристаллизации¹⁹. Таким образом, его гибкость и относительная легкость сделали TSA краеугольным камнем в определении характеристик белков. Здесь мы будем использовать TSA для анализа связывания металлов и нуклеотидов с малоизученной псевдокиназой, селенопротеином О (SelO), в качестве примера.

Киназы являются одним из наиболее целевых семейств белков в Drug Discovery²⁰. Предполагается, что примерно 10% киназ человека являются неактивными и называются псевдокиназами, поскольку в них отсутствуют ключевые каталитические остатки, необходимые для катализа^21,22. Селенопротеин О (SelO) является эволюционно консервативной псевдокиназой, в которой отсутствует консервативный аспартат, присутствующий в каталитическом мотиве HRD²³. У эукариот SelO локализуется в митохондриях и защищает клетки от окислительного стресса^24,25. Структурный и биохимический анализы показывают, что SelO переносит аденозинмонофосфат (АМФ) из АТФ в белковые субстраты в посттрансляционной модификации, известной как АМПилирование²⁵. Недавние исследования показывают, что ферменты, катализирующие АМПиляцию, могут связываться с альтернативными нуклеотидами, такими как UTP in vitro^26,27. В частности, исследования показали, что гомолог SelO из Salmonella typhimurium катализирует белковое UMPylation, или перенос UMP, марганец-зависимым образом²⁸. Учитывая эти интригующие наблюдения, мы протестировали связывание SelO с АТФ и УТФ в присутствии магния и марганца, что служит репрезентативным примером применения TSA. Следующий протокол может быть легко адаптирован для оптимизации и изучения взаимодействий других белков и добавок, представляющих интерес.