Summary

Generierung von Gefäßorganoiden aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Published: December 13, 2024
doi:

Summary

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Gefäßorganoiden unter Verwendung menschlicher pluripotenter Stammzellen vor.

Abstract

Vaskuläre Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen werden, rekapitulieren die Zelltypenvielfalt und die komplexe Architektur menschlicher Gefäßnetzwerke. Dieses dreidimensionale (3D) Modell birgt ein erhebliches Potenzial für die Modellierung der Gefäßpathologie und das In-vitro-Wirkstoffscreening . Trotz der jüngsten Fortschritte besteht nach wie vor eine zentrale technische Herausforderung darin, Organoide mit gleichbleibender Qualität reproduzierbar zu erzeugen, was für nachgelagerte Assays und Anwendungen von entscheidender Bedeutung ist. Hier wird ein modifiziertes Protokoll vorgestellt, das sowohl die Homogenität als auch die Reproduzierbarkeit der Generierung von vaskulären Organoiden verbessert. Das modifizierte Protokoll beinhaltet die Verwendung von Mikrowells und des CEPT-Cocktails (Chroman 1, Emricasan, Polyamine und der integrierte Stressreaktionshemmer trans-ISRIB), um die Körperbildung von Embryoiden und das Überleben der Zellen zu verbessern. Differenzierte, reife Gefäßorganoide, die mit diesem Protokoll erzeugt werden, werden mittels 3D-Immunfluoreszenzmikroskopie charakterisiert, um ihre Morphologie und komplexe Gefäßstruktur zu analysieren. Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Herstellung hochwertiger vaskulärer Organoide und erleichtert so möglicherweise deren Einsatz in der Krankheitsmodellierung und beim Wirkstoffscreening.

Introduction

In vitro sind in den letzten zehn Jahren mikrophysiologische In-vitro-Modelle, einschließlich Organoid- und Tissue-on-a-Chip-Systeme, entstanden 1,2,3. Diese dreidimensionalen (3D), aus menschlichen Zellen gewonnenen Systeme beheben die Einschränkungen herkömmlicher zweidimensionaler (2D) Zellkultur- und Tiermodelle, wie z. B. das Fehlen vieler Komponenten in der physiologischen Mikroumgebung bzw. genetische Unterschiede zwischen den Arten. Sie liefern physiologischere Erkenntnisse und eignen sich besser für die Modellierung von Krankheiten und das Wirkstoffscreening als herkömmliche Modelle. Unter den mikrophysiologischen Modellen haben Organoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen wurden, bewiesen, dass sie die architektonischen Merkmale nativer menschlicher Gewebe effektiv rekapitulieren und so entwickelt wurden, dass sie verschiedene menschliche Organe nachahmen, einschließlich des Gehirns 4,5, der Niere6, der Leber 7,8 und der Netzhaut9. Hier konzentrieren wir uns insbesondere auf die Erzeugung von vaskulären Organoiden aus hiPS-Zellen und skizzieren ein schlankes Protokoll, das darauf abzielt, die Variationen zwischen verschiedenen Organoidproben und -chargen zu minimieren und dadurch die Reproduzierbarkeit insgesamt zu verbessern.

Das Gefäßsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der physiologischen Homöostase in allen menschlichen Organen. Die Bildung von Gefäßen umfasst die Prozesse der Vaskulogenese und Angiogenese, die durch die Wechselwirkungen zwischen Endothel- und Wandzellen (z. B. Perizyten und vaskuläre glatte Muskelzellen) orchestriert und durch verschiedene Reize beeinflusst werden10. Penninger, Wimmer und Kollegen entwickelten die erste Methode zur Erzeugung von vaskulären Organoiden11,12, die diese beiden Prozesse nachahmt. Mit den aus dieser Methode generierten Organoiden haben ihre Gruppe12 und wir13,14 das Potenzial von Gefäßorganoiden für die Modellierung von Gefäßstörungen bei Krankheiten demonstriert. Zum Beispiel wurden in unseren jüngsten Arbeiten 13,14 unterschiedliche Phänotypen beobachtet, wie z.B. Gefäßkeimungen und Variationen der Zusammensetzung von Wandzellen, zwischen krankheitsimitierenden Gefäßorganoiden und ihren Wildtyp-Gegenstücken. Diese Beispiele zeigen, dass das Modell der vaskulären Organoide als Plattform für das Wirkstoffscreening dienen könnte, indem es krankheitsbedingte Gefäßfehlfunktionen nachahmt.

Aufbauend auf den ersten Arbeiten zur Generierung von Gefäßorganoiden11,12 wird ein überarbeitetes Protokoll vorgestellt, das die Verwendung von Mikrowells zur Erleichterung der Bildung eines homogenen Embryoidkörpers (EB) beinhaltet, ein kritischer Faktor bei der Minimierung der Variationen, die häufig innerhalb derselben Organoid-Generationscharge auftreten. Darüber hinaus wird der CEPT-Cocktail, eine Kombination aus Chroman 1, Emricasan, Polyaminen und dem integrierten Stress-Response-Inhibitor (trans-ISRIB)15, eingesetzt, um die Lebensfähigkeit von hiPSCs und differenzierten Zellen während des EB-Bildungsprozesses zu verbessern. Diese Modifikation dient hauptsächlich dazu, die Schwankungen zwischen verschiedenen Organoidproben und Chargen zu reduzieren. Mit diesem etwa zweiwöchigen Protokoll können einheitliche vaskuläre Organoide hergestellt werden, bei denen die Vaskulogenese induziert wird, um das Endothel an Tag 1 in primitiven röhrenförmigen Netzwerken zu organisieren, gefolgt von einer Angiogenese-Induktion an Tag 5, um komplexe Gefäßnetzwerke in Organoiden zu entwickeln. An Tag 12-15 sollten die erzeugten Organoide reife Gefäßnetzwerke aufweisen, die sowohl aus Endothel- als auch aus Wandzellen bestehen.

Protocol

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Schritte, die an diesem Protokoll beteiligt sind. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Materialien finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C vorzuwärmen, sofern nicht anders angegeben. Alle Zellkulturmaterialien und -materialien sollten entweder autoklaviert oder steril sein, und die Zellhandhabung s…

Representative Results

Abbildung 1A zeigt das Schema dieses Protokolls, einschließlich der Schlüsselkomponenten, die in jeder Phase verwendet werden. Die Differenzierung begann mit der EB-Bildung, gefolgt von der Mesoderminduktion und der Spezifizierung der Gefäßlinie (Abbildung 1B-D). Die Aggregate wurden im Laufe der Zeit größer und weniger kugelförmig. Organoide zeigten ab Tag 5 Ecken und Kanten. Nach der Ei…

Discussion

Das beschriebene Protokoll umfasst zwei wichtige Modifikationen für die homogene und reproduzierbare Erzeugung hochwertiger vaskulärer Organoide. Die erste Modifikation ist die Verwendung einer Mikrotiterplatte, um eine bessere Kontrolle der EB-Gleichmäßigkeit zu ermöglichen. Als Ausgangspunkt für die vaskuläre Differenzierung ist die Größe der EBs von entscheidender Bedeutung, da sie das Schicksal der Stammzellen und die Wirksamkeit der Differenzierung gegenüber verschiedenen …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten uns für die technische Unterstützung durch die Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource des Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University bedanken, die zum Teil durch den NIH Center Grant (P30CA013696) finanziert wurde. Diese Arbeit wird unterstützt von NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Abbildung 1A wurde mit BioRender erstellt.

Materials

2-Mercaptoethanol (1000x) Gibco 21985023
Accutase Sigma-Aldrich A6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs 711-546-152 reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20 °C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)  Jackson Immuno Research Labs 705-606-147 reconstitute with 0.25 mL 50% glycerol,  store at -20°C for up to 1 year, dilution ratio for use: 1:1000
B27 supplement minus vitamin A (50x) Gibco 12587010 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C, avoid freeze-thaw cycle
BMP4 ProSpec CYT-081 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
CD31 antibody  abcam ab28364 dilution ratio: 1:400
Centrifuge Eppendorf 022626001
CHIR99021 Tocris Bioscience 4423/10 make the stock solution at 12 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Chroman 1 Tocris 7163/10 make the stock solution at 100 µM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
Collagen I  Corning 40236
Confocal Microscope Nikon AXRMP/Ti2
Corning Elplasia Plates Corning 4441
Countess II FL automated cell counter Thermo Fisher AMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco 10565018
DMEM/F-12, powder Gibco 12500062 make 10x stock solution with biograde ddH2O and sterilize it with a 0.2 µm filter. Store at 4 °C.
Edi042A Cedars Sinai
Emricasan Medchemexpress LLC HY1039610MG make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20 °C for up to 1 year.
ERG antibody Cell Singali Technology 97249 dilution ratio: 1:400
Fetal Bovine Serum – Premium Atlanta Biologicals S11150 thaw at 4 °C  and aliquot, store at  -20 °C for up to five years, or store at 4 °C for up to a month
FGF2 ProSpec CYT557 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20 °C
Fluorodish Cell Culture Dish World Precision Instruments FD35-100
Forskolin Tocris Bioscience 1099 reconstitute with DMSO at a concentration of 12 mM, aliquot and store at -20 °C
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15710064
GlutaMAX supplement (100x) Gibco 35050061
Heparin, 100 kU MilliporeSigma 375095100KU reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 4 kU/mL
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Incubator Thermo Scientific 13998123
Knockout Serum Replacement Gibco 10828028 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
Matrigel, GFR Basement Membrane Matrix Corning 356230 thaw at 4 °C, aliquot and store at -80°C, avoid freeze-thaw cycle
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA, 100x) Gibco 11140050
Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV
mTeSR plus kit STEMCELL Technologies 1001130 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
N2 supplement (100x) Gibco 17502048 thaw at 4 °C, aliquot and store at -20°C, avoid freeze-thaw cycle
NaOH solution (1 M) Cytiva HyClone SH31088.01
NeuroBasal medium Gibco 21103049
NIS-Elements, ver 5.42 Nikon
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research Labs 17000121 reconstitute with 10 mL sterile ddH2O, store at 4 °C for up to two weeks
paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713S dilute with PBS
PBST, 20x Thermofisher 28352
PDGFRβ antibody R&D AF385 dilution ratio: 1:400
polyamine supplement (1000x) Sigma-Aldrich P8483
Rapiclear clearing reagent, 1.49 SUNJIN LAB RC149001
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080094
Sodium deoxycholate monohydrate Thermofisher J6228822 dissolve with ddH2O for 1% (wt/v) stock solution
TBST, 20x Thermofisher 28360
trans-ISRIB Tocris Bioscience 5284/10 make the stock solution at 1 mM with DMSO, and store at -20°C for up to 1 year.
Tritin X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher 15250061
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-100ML
VEGF-A ProSpec CYT-116 reconstitute with sterile ddH2O at a concentration of 100 ng/µL, aliquot and store at -20°C

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Xu, C., He, S., Zhu, Y., Crasto, G., Chen, C., Clay, M. L., Lao, Y., Leong, K. W. Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (214), e67125, doi:10.3791/67125 (2024).

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