Gewebekultureinsätze mit Kunststoffmembranen sind der goldene Standard in Zellkulturlaboren als durchlässige Stützen zur Etablierung von Zellschichten und Modellen von Barrieregeweben. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um die Kunststoffmembran durch eine biologisch relevantere Membran zu ersetzen, die aus einem rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenprotein besteht.
Die Replikation von Gewebebarrieren ist entscheidend für die Generierung relevanter In-vitro-Modelle zur Bewertung neuartiger Therapeutika. Heutzutage geschieht dies üblicherweise mit Hilfe von Gewebekultureinsätzen mit einer Kunststoffmembran, die eine apikale und eine basale Seite erzeugt. Diese Membranen unterstützen nicht nur die Zellen, sondern sind auch weit davon entfernt, ihr natives Gegenstück, die Basalmembran, nachzuahmen, bei der es sich um eine nanofibrilläre, proteinbasierte Matrix handelt. In dieser Arbeit zeigen wir einen einfachen Weg, um die biologische Relevanz der Gewebekultureinlagen erheblich zu verbessern, indem die plastische Membran durch eine aus einem rein rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenprotein ersetzt wird. Die Seidenmembran bildet sich durch Selbstorganisation und haftet spontan an einem membranfreien Gewebekultureinsatz, wo sie die Zellen stützen kann. Kundenspezifische Gewebekultureinsätze können mit einem Standard-3D-Drucker gemäß den Anweisungen im Protokoll gedruckt werden, oder es können stattdessen kommerzielle Einsätze gekauft und verwendet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Kultursystem mit Seidenmembranen in Inserts aufgebaut ist und wie anschließend die gleichen Zellkultivierungstechniken implementiert werden können, die bei traditionellen, kommerziell erhältlichen Inserts angewendet werden.
In-vitro-Modelle, die Gewebebarrieren replizieren können, haben aufgrund ihrer Anwendbarkeit bei der Erprobung neuartiger Therapeutika und der Erleichterung des Verständnisses grundlegender Krankheitsmechanismen zunehmende Aufmerksamkeit erhalten 1,2. Um die native Mikroumgebung genau nachzubilden, ist es wichtig, die Funktion der Basalmembran (BM), eines hochspezialisierten extrazellulären Matrixkomplexes (ECM), zu rekapitulieren. Das BM kommt in fast jedem Gewebe des menschlichen Körpers vor, wo es Endothel- und Epithelzellen unterstützt und sie vom darunter liegenden Gewebe trennt 2,3. Neben der physischen Unterstützung reguliert und erhält das BM auch biochemische Signale zwischen den Zellen und dem umgebenden Gewebe. Diese wichtigen Funktionen machen es notwendig, Gerüste zu entwerfen, die der Struktur sowie den mechanischen und funktionalen Eigenschaften des nativen BM3 ähneln.
Eine der gebräuchlichsten Methoden, die BM in vitro nachzuahmen, ist heute die Verwendung von kommerziell erhältlichen Gewebekultur-Inserts (TC-Inserts). Dabei handelt es sich im Wesentlichen um Kunststoffzylinder mit einer durchlässigen Membran, die die Kammer in apikale und basolaterale Seiten 4,5 teilt. Die Membranen in kommerziellen Einsätzen sind zwar einfach zu verwenden, aber in der Regel starr, spurgeätzt und bestehen aus Polymeren wie Poly(carbonat) (PC) und Poly(ethylenterephthalat) (PET)3,4,6. Sie sind flexibel in Bezug auf Durchmesser, Porendichte und Größe und können beschichtet werden, um die Zelladhäsion zu verbessern, aber es fehlen alle anderen relevanten Merkmale des BM, wie z. B. vergleichbare Dicke6, vernetzte Porosität, faserige Architektur und relevanter Elastizitätsmodul3.
Die Standardisierung von TC-Einsätzen und ihre einfache Handhabung haben mehrere Gruppen, darunter auch unsere, dazu inspiriert, die Kunststoffmembran durch ein eher in vivo-ähnliches Gegenstück zu ersetzen (siehe Tabelle 1). Die verwendeten Materialien reichen von Polymeren wie Polydimethylsiloxan (PDMS)7, Poly(lactid-co-caprolacton) (PLCL)8 und Polycaprolacton (PCL)4,9,10 bis hin zu proteinbasierten Materialien wie Gelatine 2,11,12, Kollagen 5,13 und rekombinanter Spinnenseide 14,15,16,17. Membranen aus diesen Materialien wurden auf verschiedene Weise befestigt, sowohl an handelsüblichen Einsätzen, von denen die Membran entfernt wurde 4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21 sowie auf kundenspezifische Einsätze, die im 3D-Druck 1,11,15,17,20 oder im Spritzguss 9,22 hergestellt werden. Die meisten von ihnen sind jedoch in Bezug auf die Dicke noch weit davon entfernt, dem nativen BM zu ähneln, wobei die Nachbildungen von Hunderten11,18 bis zu einigen Mikrometern 5,10,14,21,22 reichen. Viele von ihnen erfordern auch eine komplexe Formations- und/oder manuelle Befestigungsmethoden 1,7,13,14,18,19,21, was die Skalierung und Replikation in anderen Laboren zu einer Herausforderung macht.
Darin stellen wir eine einfache Methode vor, um eine Seidenmembran zu formen und an Einsätzen zu befestigen, und zeigen, wie Zellen auf beiden Seiten der Membran kultiviert werden können. Die Seidenmembranen werden durch Selbstorganisation des Proteins FN-4RepCT (FN-silk) an der Flüssig-Luft-Grenzfläche einer stehenden Lösunggebildet 16,17. FN-Seide ist eine rekombinant hergestellte Kurzversion von Major Ampullulate Spidroin 1 aus Euprosthenops australis, funktionalisiert mit einem RGD-Motiv, das von Fibronektin23 abgeleitet ist. Es hat sich gezeigt, dass es sich zu fibrillären Matrizen zusammensetzt, die die Zelladhäsion, das Wachstum und die Migration fördern 15,16,17,23,24,25. Das Verfahren zur Befestigung der Membran auf dem Einsatz beruht auf Spontanadhäsion und hat sich für kommerziell erhältliche Inserts, von denen die Membran entfernt wurde16, sowie für 3D-gedruckte Inserts aus Polymilchsäure (PLA)17 und Dental LT15 als geeignet erwiesen. In diesem Artikel wird beschrieben, wie diese Methode für Einsätze verwendet wird, die mit Dental LT gedruckt wurden. Nachdem die FN-Seidenmembranen auf die Einsätze aufgebracht wurden, können sie im Wesentlichen wie handelsübliche Gewebekultureinlagen behandelt werden. Kurz gesagt, wir stellen eine einfache Methode vor, um in vitro relevantere Modelle von Gewebebarrieren zu generieren, indem Kunststoffmembranen durch eine proteinbasierte FN-Seidenmembran ersetzt werden.
Das hier beschriebene Protokoll skizziert einen einfachen Weg, biologisch relevante Zellkulturinsertionen herzustellen. Es beginnt mit dem Drucken der Inserts, gefolgt von der Bildung und Befestigung von FN-Seidenmembranen und endet mit der Darstellung, wie Zellen sowohl auf der apikalen als auch auf der basalen Seite der Membran ausgesät werden können. Es gibt einen wirklich entscheidenden Schritt in diesem Protokoll, um den langfristigen Erfolg von Zellkulturen zu gewährleisten, und das ist das Absenken und Anheben der Inserts auf die Membran. Die erfolgreiche Durchführung dieser Schritte wird zu einem Seidenmembran-Einsatz-Kultursystem führen, das in der Lage ist, Zellkulturen ähnlich wie kommerziell erhältliche Systeme mit synthetischen Membranen zu widerstehen. Um dies zu gewährleisten, wurden an den Seiten der speziell angefertigten Einsätze Führungsschienen implementiert, die verhindern, dass diese schräg abgesenkt oder seitlich in der Vertiefung verschoben werden, was zu einer ungleichmäßigen Membranhaftung führen würde, die Schwachstellen und in der Folge Leckagen erzeugen würde. Es kommt häufig vor, dass kleinere Probleme auftreten, wenn ein Protokoll zum ersten Mal befolgt wird. Um dem neuen Benutzer zu helfen, sie zu umgehen, sollten sie auftreten, während er das oben beschriebene Protokoll befolgt, haben wir in Tabelle 3 mögliche Probleme und deren Lösungen skizziert.
Es hat sich gezeigt, dass die Membran selbst für die Modellierung verschiedener Barrieregewebe von Vorteil ist (siehe Tabelle 2). Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass das Harz, das zum Drucken der hierin enthaltenen Einsätze verwendet wird, nicht ausgiebig auf seine Wirkung auf die Lebensfähigkeit anderer Zelltypen getestet wurde. Obwohl wir bisher keine derartigen Probleme festgestellt haben, ist es möglich, dass das Harz die Lebensfähigkeit und das Wachstum einiger empfindlicher Zellen negativ beeinflussen könnte. Es wird daher empfohlen, einen ähnlichen Viabilitätstest wie den hier vorgestellten durchzuführen, um die Kompatibilität des Harzes mit jedem verwendeten Zelltyp zu überprüfen. Wenn Zytotoxizität auftritt, sollte ein gründlicheres Aushärtungs- und/oder Auslaugungsprotokoll erstellt werden, um zu verhindern, dass nicht ausgehärtete Monomere im Laufe der Zeit auslaugen und die Zellen schädigen. Ein Beispiel für ein solches Protokoll, das für das Harz verwendet wurde, mit dem die Einsätze innerhalb dieses Protokolls gedruckt wurden, findet sich in der Zusatzdatei 2. Dieses Protokoll wurde zuvor verwendet, um Inserts für die Kultivierung von bEnd.3 brain endothelial auf Seidenmembranen für bis zu 8 Tage vorzubereiten15.
Der Hauptvorteil der in dieser Arbeit vorgestellten Methode besteht darin, dass sie eine einfache Möglichkeit bietet, aktuelle plastische Membranen auf Gewebekultureinsätzen zu ersetzen und somit statische Gewebekulturmodelle zu verbessern. Die Haupteinschränkung besteht darin, dass der Benutzer Zugang zu 3D-Druckgeräten benötigt oder Zeit in einer Einrichtung kaufen muss, um seine Einsätze zu drucken. Dies könnte jedoch bei Bedarf umgangen werden, indem nach der Entfernung der Membranen kommerzielle Gewebekultureinlagen verwendet werden. Darüber hinaus können die Seidenmembranen zwar im Wesentlichen als reguläre Gewebekultureinlagen verwendet werden, sind aber dünner und haben eine Proteinzusammensetzung und sind daher empfindlicher als ihre derzeitigen synthetischen kommerziellen Gegenstücke. Daher müssen sie von den Benutzern sorgfältiger behandelt werden und müssen feucht gehalten werden, um ihre Elastizität zu erhalten. Zu beachten ist, dass die Membranen dem Dehnen und Aufblasen standhalten können16,17, wodurch sie sich beispielsweise zur Nachahmung von Atembewegungen eignen. Trotzdem ist es wahrscheinlich, dass neue Benutzer einige Membranen in der Anfangsphase zerbrechen werden, aber mit zunehmender Erfahrung im Umgang mit Membranen wird erwartet, dass die Erfolgsquote steigt. Wenn weiterhin Probleme auftreten, sollte der Benutzer zur Fehlerbehebung in Tabelle 3 nachsehen.
In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Alternativen zu den kommerziellen Kunststoffeinsätzen vorgestellt (Tabelle 1), und jedes Mal, wenn die Leistung von Zellkulturen verglichen wurde, haben die neuen, biologisch relevanteren Membranen bessere Ergebnisse erzielt als ihre kommerziellen Kunststoff-Pendants 2,5,6,7,14,22. Dies wurde vor allem in Bezug auf eine verbesserte Barrierefunktionbeobachtet 2,5,6,7,14,22, aber auch in Bezug auf die Bildung von mehr nativem Zellwachstum14 und erhöhte Wechselwirkungen durch die Membran in Co-Kultursystemen 7 . Dieser Trend wurde bereits bei der Etablierung eines Blutgefäßwandmodells für die FN-Seidenmembranen beobachtet. In dieser Studie wurden HDMEC- und glatte Muskelzellen (SMCs) auf gegenüberliegenden Seiten der Membran gezüchtet. Es konnte gezeigt werden, dass die SMCs bei der Co-Kultivierung mit dem HDMEC auf den FN-Seidenmembranen im Vergleich zu den kommerziellen PET-Membranen eine dickere ECM sezernierten. In ähnlicher Weise errichtete das HDMEC eine engere Barriere auf den FN-Seidenmembranen17. Die verbesserten Zellkulturergebnisse sind wahrscheinlich auf eine verbesserte zelluläre Kommunikation und mehr In-vivo-ähnliche Kultivierungsbedingungen zurückzuführen. Die FN-Seidenmembran kommt der nativen BM in Bezug auf Dicke, Struktur und mechanische Eigenschaften deutlich näher. Die native BM ist zwischen 20 nm und 3 μm22 dünn, die PET-Membranen 10 μm und die FN-Seidenmembranen etwa 1 μm und liegen damit deutlich im nativen Bereich. Die Struktur der FN-Seidenmembran ist ebenfalls nanofibrillär16, genau wie die native BM22, während die PET-Membran aus Kunststoff mit spurgeätzten Poren besteht, die in der Regel zwischen 0,4 μm und 8 μm Durchmesserhaben 7. Die PET-Membranen sind auch viel steifer als die BM und haben einen Elastizitätsmodul von etwa 2 GPa, verglichen mit der BM, die von kPa bis MPa reicht, aber im Allgemeinen mit etwa 250-500 kPa22 angegeben wird. Die FN-Seidenmembranen haben einen Elastizitätsmodul von 115 kPa16, was innerhalb der nativen Bedingungen liegt. Es sollte auch beachtet werden, dass, sobald Zellen auf der Membran gewachsen sind, ihre Stärke zum dominierenden Faktor wird, nicht die Membran selbst17. Abschließend ist auch zu beachten, dass die integrierte Funktionalisierung des FN-Seidenproteins dafür sorgt, dass die Zellen direkt an der Membran haften und somit eine Beschichtung nicht notwendig ist. Bei PET-Membranen ist es oft Standard, mit einem EZM-Protein zu beschichten, um eine korrekte Zelladhäsion zu gewährleisten7.
Vergleicht man die FN-Seidenmembran mit anderen Ansätzen, die zur Substitution der PET-Membran verwendet werden (siehe Tabelle 1), so ist der Hauptvorteil unserer Methode die Verwendung des rekombinant hergestellten funktionalisierten Seidenproteins. Dies gewährleistet Reproduzierbarkeit und definierte Kulturbedingungen im Gegensatz zu anderen proteinbasierten, tierischen Materialien wie Kollagen. Beachten Sie nochmals, dass die Funktionalisierung des Proteins sicherstellt, dass keine Beschichtungen erforderlich sind, da die Zellen gut an den Membranen haften, da sie17 sind. Darüber hinaus basiert die hierin beschriebene Herstellung von Membranen auf Seidenbasis auf Selbstorganisation und erfordert keine komplexe Einrichtung oder den Einsatz aggressiver Chemikalien, im Gegensatz zu vielen anderen Techniken, die beispielsweise auf Elektrospinnen beruhen. Durch die spontane Adhäsion der Membran auf dem Einsatz entfällt auch die manuelle Handhabung von zweiteiligen Einsätzen, Verklebungen und Silikon-Montageringen, wodurch die Skalierung vereinfacht und eine einfache Reproduzierbarkeit in jedem Labor ermöglicht wird. Neben der einfachen Herstellung lässt sich unser Verfahren leicht an die experimentellen Bedürfnisse des Benutzers anpassen, da verschiedene Einsatzmaterialien verwendet werden können und die Membrandicke durch Einstellen der Seidenkonzentration der Ausgangslösung eingestellt werden kann16. Schließlich kann dieses Protokoll unseres Wissens nach die bisher dünnste freistehende Membran liefern, die an einem Gewebekultureinsatz befestigt ist, was die größte Ähnlichkeit mit der nativen Basalmembran ermöglicht.
Das hier vorgestellte Protokoll zur Bildung und Handhabung von Seidenmembranen ist für jeden, der es gewohnt ist, mit Gewebekultureinsätzen in einem Zellkulturlabor zu arbeiten, einfach zu verwenden. Es ist ein einfacher Weg, um von plastischen Membranen zu einem eher in vivo-ähnlichen Gegenstück überzugehen, was die Generierung relevanterer Gewebemodelle unter Verwendung verschiedener Zelltypen ermöglicht (Tabelle 2). Die Seidenmembranen können Zellkulturen auf ihrer apikalen oder basalen Seite sowie beidseitig Co-Kulturen verschiedener Zelltypen unterstützen17. Die auf den Seidenmembranen entwickelten Barrieregewebemodelle können für das gleiche Anwendungsspektrum wie die Gewebekultureinsätze verwendet werden, einschließlich Wirkstoffscreenings sowie Permeations- und Infektionsstudien. In Fällen, in denen die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen von Interesse ist, wurde gezeigt, dass sie die TC-Inserts aufgrund ihrer eher in vivo-ähnlichen Eigenschaften übertreffen17.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Spiber Technologies AB für die Bereitstellung des rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenproteins und Eline Freeze für den Druck eines großen Teils der 3D-gedruckten Einsätze.
CHEMICALS | |||
Alexa Fluor 488 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A-21121 | Goat anti-mouse, Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A12379 | Dilution 1:400 |
anti-ZO-1 (1A12) antibody | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | 33-9100 | Mouse anti-human, Monoclonal, Dilution 1:200 |
Dextran, Alexa Fluor 680; 3,000 MW, Anionic | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | D34681 | Diluted 2,5% (w/v) in 200 ul of culture medium |
DMEM/F-12 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 31330095 | Supplemented with 5% v/v FBS and 1% v/v Penicillin-Streptomycin |
Ethanol | Solveco | 1326 | 70% (CAS-no 64-17-5) |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, United States | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 16140071 | |
FN-silk | Spiber technologies AB | Store at -80 °C | |
Isopropanol, EMPARTA ACS analytical reagent | Supelco | 1096342511 | ≥99.5% (CAS-no 67-63-0) |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
PBS | Swedish Veterinary Agency / Statens veterinärmedicinska anstalt | 992420 | without Ca and Mg, filtered |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 11548876 | |
MATERIAL | |||
Dental LT Clear Resin | Denthouse | #DLCL-01 | |
HaCaT cells | CLS | 300493 | |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24-well | Fisher Scientific | 10604903 | |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 48-wel | Fisher Scientific | 10644901 | |
TC insert, for 24-well plates, PET, transparent | Sarstedt | 83.3932.041 | pore size: 0.4 µm |
ThinCert Cell Culture Inserts, translusent membrane (PET) | Greiner | 662640 | pore size: 0.4 µm |
EQUIPMENT | |||
EVOM meter with chopsticks | World Precision Instruments (WPI) Germany, GMBH | ||
Form 3B | FormLabs | ||
Form Wash | FormLabs | ||
Form Cure | FormLabs | ||
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisherbrand | ||
Inverted fluorescence microscope Eclipse Ti | Nikon | ||
Inverted fluorescence microscope DMI6000 B | Leica | ||
Laminar flow hood Ninosafe, class II | Labolutions | ||
Midi CO2 Incubator, 40 L | Thermo Scientific |