Nachweis von DNA-Brüchen in sich teilenden menschlichen Zellen durch neutralen Kometen-Assay
Summary
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Ausmaß der DNA-Schäden zu untersuchen, die während der DNA-Replikation auftreten. Unter neutralen Bedingungen kann die Induktion von DNA-Brüchen innerhalb eines kurzen Zeitrahmens gut beurteilt werden. Darüber hinaus ist das Protokoll an andere Zelltypen und verschiedene Replikationsstressreagenzien anpassbar.
Abstract
Die DNA-Replikation wird ständig durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Stressoren herausgefordert, die die DNA schädigen können. Solche Läsionen, die während der Genomduplikation auftreten, können Replisomen blockieren und Replikationsgabeln in Doppelstrangbrüche umwandeln. Wenn diese toxischen DNA-Brüche nicht repariert werden, können sie chromosomale Umlagerungen auslösen, was zu einer erhöhten Instabilität des Genoms und einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer zellulären Transformation führt. Darüber hinaus weisen Krebszellen einen anhaltenden Replikationsstress auf, was die Anfälligkeit der Replikationsgabel in Tumorzellen zu einer attraktiven Strategie für die Chemotherapie macht. Eine äußerst vielseitige und leistungsstarke Technik zur Untersuchung von DNA-Brüchen während der Replikation ist der Comet-Assay. Diese Gelelektrophorese-Technik detektiert zuverlässig die Induktion und Reparatur von DNA-Brüchen auf Einzelzellebene. Darin wird ein Protokoll skizziert, das es den Forschern ermöglicht, das Ausmaß der DNA-Schädigung bei der mitotischen Teilung menschlicher Zellen mit Hilfe von Gabel-Stalling-Mitteln über mehrere Zelltypen hinweg zu messen. Die Kopplung mit der automatisierten Kometenbewertung ermöglicht eine schnelle Analyse und erhöht die Zuverlässigkeit bei der Untersuchung der Induktion von DNA-Brüchen.
Introduction
Der Comet-Assay ist eine Gelelektrophorese-Methode, die zum Nachweis von DNA-Brüchen auf Einzelzellebene verwendet wird. Es beruht auf dem Prinzip, dass offene DNA-Brüche unter elektrophoretischen Bedingungen wandern, während intakte DNA weitgehend statisch bleibt. Gebrochene DNA wandert, weil Brüche zu einer Entspannung der supercoiled DNA führen, was zu einer allmählichen räumlichen Verlagerung in Richtung der Anode in der elektrophoretischen Kammer führt, was zu einem kometenähnlichen Aussehen führt, das durch Immunfluoreszenz beobachtet wird 1,2. Das Ausmaß der DNA-Schädigung wird dann gemessen, indem die Menge an gebrochener DNA, die im Verhältnis zur kompakten DNA migriert ist, quantifiziert wird.
Die beiden am häufigsten verwendeten Kometen-Assay-Methoden sind der alkalische Kometen-Assay (AC) und der neutrale Kometen-Assay (NC). Der AC-Assay wird unter denaturierenden Bedingungen mit einer Lösung mit hohem alkalischen pH-Wert durchgeführt, während der NC-Assay in einer Lösung mit neutralem pH-Wert durchgeführt wird. Sowohl NC- als auch AC-Assays können DNA-Brüche, die im Zellkern auftreten, zuverlässig nachweisen. Die alkalische Variante ist aber auch vorteilhaft für die Detektion alkali-labiler Stellen3. Beide Formate des Assays erfordern die Verwendung von Lysebedingungen, um sicherzustellen, dass die DNA vor der Elektrophorese frei von Proteinen ist.
Dieser Assay ist eine einfache Methode zum Nachweis von DNA-Brüchen und bietet mehrere einzigartige Vorteile bei der Bestimmung von zellulären DNA-Schäden. Die Methode ist relativ einfach einzurichten und erfordert Reagenzien, die entweder im Labor hergestellt oder von kommerziellen Anbietern gekauft werden können. Da es sich um eine Einzelzellauflösungstechnik handelt, benötigt der Assay nur sehr wenig Ausgangsmaterial. Insbesondere kann der NC-Assay Brüche mit hoher Empfindlichkeit messen, die Berichten zufolge zwischen 50 und 10.000 Brüche pro Zelle erkennensoll 4. Die Vielseitigkeit dieser Technik zeigt sich in ihrem breiten Anwendungsspektrum, darunter Ökotoxikologie5, Human-Biomonitoring6 und Genotoxizitätsstudien7. Der Assay kann auch zuverlässig über verschiedene Zelltypen hinweg eingesetzt und für Hochdurchsatz-Assays8 und für die Beurteilung von Brüchen in bestimmten genomischen Regionenangepasst werden 9. Somit dient dieser Assay als schnelle und zuverlässige Technik zur Untersuchung der Bruchbildung auf Einzelzellebene.
Der Prozess der DNA-Replikation wird ständig durch mehrere endogene und exogene Stressoren herausgefordert 10,11. Ein Stillstand der Replisomen aufgrund solcher Läsionen kann zu DNA-Brüchen führen und zu einer erhöhten Instabilität des Genoms führen. DNA-Brüche entstehen auch häufig als Replikationszwischenprodukte, um die DNA-Reparatur zu erleichtern12. Darüber hinaus induzieren mehrere Chemotherapeutika replikationsabhängige Doppelstrangbrüche (DSBs), wie z. B. Camptothecin (CPT)13,14,15 und PARP-Inhibitoren 16,17. Daher dient dieser Assay als leistungsfähige Methodik, um die Art von DNA-Läsionen zu untersuchen, die Prozessierung von Replikationsgabeln zu beurteilen und das therapeutische Potenzial von DNA-schädigenden Wirkstoffen zu untersuchen. Anpassungen des Assays, die die Markierung neu synthetisierter DNA mit BrdU beinhalten, waren nützlich für die Untersuchung der replikationsassoziierten Stressphänotypen 18,19,20,21. Insbesondere ist der NC-Assay eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der DNA-Bruchinduktion im Rahmen der Replikation, wie Studien zur Charakterisierung von Gabelproteinen22,23, zur Analyse von Replikationszwischenprodukten24,25 und zur Untersuchung von Transkriptions-Replikationskonflikten bei der Genomerhaltunggezeigt haben 26,27. Darin skizzieren wir ein NC-Assay-Protokoll mit dem Ziel, DNA-Brüche während der Replikation in menschlichen Zellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann von Forschern, die daran interessiert sind, Replikationsstress-assoziierte Schäden in einer Vielzahl von sich teilenden menschlichen Zellen zu bewerten, leicht implementiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen NC-Assay zur Beurteilung von DNA-Brüchen in menschlichen Zellen, die sich einer aktiven Replikation unterziehen. Das Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und kann von den Forschern problemlos an Bedingungen mit hohem pH-Wert für alkalische Analysen angepasstwerden 8. Es umfasst zwei kritische Schritte, wie in den Schritten 3.7 und 4.5 beschrieben. In Schritt 3.7 ist es wichtig, die geschmolzene Agarose mit den Zellen gleichmäßig über die Vertiefung zu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Dungrawala-Labors für ihren Input und ihr Feedback. Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R35GM137800 für die Huntington-Krankheit finanziert.
Materials
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | |
| Camptothecin | Selleckchem | S1288 | |
| Comet LMAgarose (LMA) | R&D systems | 4250-050-02 | |
| CometAssay Electrophoresis System II | R&D systems | 4250-050-ES | Includes electrophoresis tank, safety lid, cables, 2/20 wells slide trays and slide tray overlay |
| CometScore software | TriTek | open-sourced | |
| CometSlide | R&D systems | 4250-050-03 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | FisherSci | D128-4 | |
| Epifluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium | Bio-Techne | S11150 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| GraphPad Prism 10.0 | GraphPad | ||
| HEK293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| hTERT-RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Hydroxyurea | Millipore Sigma | H8627 | |
| PARP inhibitor Olaparib | Selleckchem | S8096 | |
| PowerPac | FisherSci | FB300Q | |
| Surface Treated Sterile Tissue Culture Plate | FisherSci | FB012927 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x) | FisherSci | S7567 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 | |
| UVP HB-1000 Hybridization Incubator | FisherSci | UVP95003001 |
Referenzen
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