Methoden zum Tätowieren von Xenopus laevis mit einer rotierenden Tätowiermaschine

Tiermodelle sind nützliche Werkzeuge, um Fragen der menschlichen Gesundheit zu untersuchen. In der Praxis erfordert die biomedizinische Forschung mit Tiermodellen eine sorgfältige Organisation und Pflege einer gesunden Tierkolonie. Best Practices für einen ethischen Umgang und eine ethische Tierhaltung zielen darauf ab, die Anzahl der für Versuche benötigten Tiere zu reduzieren und die Praktiken zu verfeinern, um den Tierschutz zu gewährleisten¹. Die Gattung der Krallenfrösche, zu denen auch Xenopus laevis (X. laevis; Afrikanischer Krallenfrosch) und Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Westlicher Krallenfrosch) werden seit den 1930er Jahren in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, als X. laevis von südafrikanischen Ärzten zur Durchführung der ersten Schwangerschaftstests verwendet wurden². Während moderne Schwangerschaftstests keine Frösche mehr erfordern, besteht die Rolle der Xenopus-Forschung fort. Zu den Vorteilen der Verwendung von Xenopus für die biomedizinische Forschung gehören die gut annotierten Genome³, der ganzjährig induzierbare Eisprung großer Gelege⁴ und extern gelegte Eier, die für eine In-vitro-Fertilisation geeignet sind. Diese Eigenschaften machen sie zu einer nützlichen Bereicherung für die Embryologie und Entwicklung von Wirbeltieren ^5,6,7, die Grundlagen der Molekular- und Zellbiologie ^7,8,9,10 und für die Modellierung menschlicher Krankheiten 7,11,12,13.

Zuverlässige Methoden zur Verfolgung einzelner Xenopus-Tiere sind unerlässlich, um biologische Replikate zu erfassen und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit in der Forschung zu verbessern. Da Xenopus häufig in Gruppen untergebracht sind, ermöglicht die Tiermarkierung den Forschern, einzelne Tiere leicht zu verfolgen⁴. Die Führung einer genauen Aufzeichnung der Tiere kann Zeit und Ressourcen sparen und die Fähigkeit zur Nachverfolgung der Gesundheit der Tiere verbessern. Zum Beispiel kann die individuelle Identifizierung von Tieren die Organisationsabläufe für die Generierung transgener Xenopus-Linien verbessern, da dies mehrere Generationen von Fröschen mit spezifischen Genotypen erfordert, die durch Sequenzierung¹⁴ verifiziert werden, was eine Organisation und individuelle Identifizierung der Tiere erfordert. Dies gilt insbesondere dann, wenn diesen Mutationen leicht erkennbare adulte Phänotypen fehlen. In ähnlicher Weise profitiert die Verwendung von Xenopus-Eizellen und -Embryonen zur Untersuchung grundlegender Zell- und Entwicklungsbiologie von der Verfolgung einzelner Tiere. Nach dem Auslösen des Eisprungs müssen sich die Tiere mindestens 3 Monate lang ausruhen, um gesundheitliche Komplikationen wie das Hyperovulationssyndrom^{zu vermeiden 15}. Individuelle Identifizierungsmethoden stellen sicher, dass die Tiere nicht zu häufig zum Eisprung veranlasst werden.

Die Kennzeichnung und Verfolgung von Tieren ermöglicht es dem Laborpersonal auch, die gesundheitlichen Bedenken der Tiere zu verfolgen. Die Erkrankung von Tieren desselben Genotyps kann auf übermäßige Inzucht oder unvorhergesehene gesundheitliche Bedenken im Zusammenhang mit dem Transgen hinweisen. In ähnlicher Weise können Tiere, die nach dem kürzlichen Eisprung krank werden, auf Probleme mit Reagenzien, Materialien oder Techniken hinweisen. Die Verfolgung von Tieren und ihrer Gesundheit ermöglicht es Labormitarbeitern und Tierärzten, nachzugehen, wenn Bedenken wieder auftauchen, und vorbeugende Maßnahmen zu ergreifen, um zukünftige Krankheiten zu verhindern. Bei Säugetieren gibt es zahlreiche Bestimmungsmethoden. Zu den dauerhaften Methoden für Mäuse gehören das Stanzen von Ohren, Ohrmarken, Tätowieren und subkutane Mikrochips¹⁶. Diese können Tiere innerhalb einer Kolonie oder eines Käfigs eindeutig und zuverlässig unterscheiden und können vom Laborpersonal einfach verabreicht werden. Methoden wie das Ohrlochen sind minimalinvasiv, erfordern nur ein Spezialgerät und funktionieren für Tiere jeden Alters. Während diese Systeme für Mäuse unkompliziert und nützlich sind, stellt ihr Einsatz bei Fröschen eine Reihe einzigartiger Herausforderungen dar. Fröschen und anderen Amphibien fehlt eine Ohrmuschel (äußere Ohrstruktur). Einige Forscher haben Tags am Kiefer, an der Zehe oder an den Hintergliedmaßen des Tieres angebracht^17,18. Dieser Ansatz führte zu verschiedenen Problemen: Kiefermarken verursachten Irritationen, und aufgeregte Frösche versuchten, mit ihren Vordergliedmaßen Marken abzureißen¹⁷. Zehenmarken durchbohrten das Gurtband zwischen den Zehen, beeinträchtigten die Bewegung und bergen die Gefahr, verloren zu gehen. Daher benötigen Amphibien ihre eigenen Methoden zur Bestimmung. In der Vergangenheit wurde das Zehenkürzen auch zur Markierung von Amphibien verwendet^17,19. Die Zehe wird mit einer scharfen Schere geschoren, und das Tier kann an der Länge der Zehen an den Vorder- und Hinterpfoten oder an dem Winkel, in dem die Zehe nachgewachsen ist (bei Salamandern), identifiziert werden. Diese Methode wirft jedoch die ethische Befürchtung auf, dass das Scheren der Zehen die Bewegung des Tieres beeinträchtigen kann¹⁷. Darüber hinaus kann dies zu Blutungen führen und ein Infektionsrisiko mit sich bringen. Ein weiteres etabliertes Markierungssystem sind die Hautautotransplantate, bei denen die Haut von einem Teil des Strahls entnommen und chirurgisch mit einem anderen Teil verbunden wird. Zum Beispiel wird ein Verfahren beschrieben, um den Rücken oder die Schulter eines Frosches mit Hilfe eines hellen Hauttransplantats aus seiner Brust^{zu markieren 20}. Hauttransplantationen sind auch mit Einschränkungen und Risiken verbunden: Das Verfahren ist invasiv und birgt das Risiko einer Aeromonas hydrophila-Infektion oder des roten Beins, einer potenziell tödlichen Erkrankung; Die vollständige Heilung des Autotransplantats dauert bis zu 6 Wochen; Und mit den beschriebenen Methoden können nur 6 Frösche zusammen untergebracht werden, da die Plätze für ein Autotransplantat^{begrenzt sind 20}.

Zu den weniger invasiven Markierungsansätzen gehören Glasperlen und Transponderchips^17,19. Bei der Glasperlenmethode werden Glasperlen auf eine kleine Naht aufgefädelt und in die Haut des Frosches eingenäht. Dies bietet eine größere Variabilität als Hautautotransplantate mit mindestens 60 unverwechselbaren Farbkombinationen. Es besteht jedoch die Gefahr, dass sich die Naht lösen und die Kügelchen verloren gehen. Alternativ kann ein Mikrochip-Transponder unter die Haut im dorsalen Lymphsack des Frosches implantiert werden. Dies gilt als die dauerhafteste Markierungsmethode und ermöglicht es, eine potenziell unendliche Anzahl von Tieren individuell zu identifizieren und zu katalogisieren. Dies ist jedoch auch die teuerste Methode, da einzelne Mikrochips teuer sind und die Markierung einer großen Kolonie kostspielig wäre. Mikrochips benötigen auch einen speziellen Scanner, um¹⁹ zu lesen. Ein gängiger Ansatz zur Identifizierung von Xenopus bezieht sich auf die natürliche Färbung und Musterung der Tiere. Dies funktioniert besonders gut bei Fröschen wie X. laevis, die ausgeprägte Muster aufweisen, die bis ins Erwachsenenalter bestehen bleiben. Diese Muster können sich jedoch im Laufe der Zeit bei Belastung ändern, und die Färbung kann anders aussehen, wenn Frösche zwischen transparenten und getönten Behältern bewegt werden¹⁵. Darüber hinaus ist diese Identifizierungsmethode weniger nützlich für X. tropicalis, die im Vergleich zu X. laevis weniger ausgeprägte Markierungsmuster aufweist, oder für Albino-Tiere, die keine Farbmarkierungen aufweisen²¹. Selbst bei Spezies mit unterschiedlichen Markierungen kann das Laborpersonal die Platzierung und Größe der Markierungen unterschiedlich interpretieren, was zu Fehlern bei der Identifizierung führen kann. Aus diesem Grund ist das Fotografieren von Tieren in Verbindung mit einer zusätzlichen Identifizierungsmethode am zuverlässigsten. Daher versuchen wir, Xenopus-Tiere mit einer Technik zu markieren und zu identifizieren, die leicht erkennbar, dauerhaft und minimalinvasiv ist.

Es gibt nur wenige veröffentlichte Quellen, die Methoden zum Tätowieren von Amphibien beschreiben. Das Tätowieren wurde zusammen mit anderen Branding-Techniken beschrieben, darunter Hitzemarken, Silbernitratmarken und Gefriermarken¹⁷. In der gleichen Ressource wurde das Tätowieren durch Zeichnen von Ziffern mit einer 27G-Injektionsnadel durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass der Prozess keine Infektion verursachte, im Gegensatz zu den anderen Branding-Techniken, bei denen ein Draht verwendet wurde, der zu einer Ziffer oder einer anderen Markierung geformt wurde. In einer anderen Quelle wurde eine elektrische Tätowiermaschine (beschrieben als vibrierende Nadel) verwendet, um Frösche zu markieren, aber es wurden nur wenige Details über die Technik geliefert^17,19. Die Autoren warnen davor, dass dieses Verfahren durch die Störung der schützenden Schleimschicht des Frosches das Risiko für ein rotes Bein erhöht. Es gibt zwar keine Markierungs- oder Identifizierungsmethode, die sowohl völlig nicht-invasiv (z. B. Fotos) als auch dauerhaft (z. B. Mikrochips) ist, aber das Tätowieren stellt einen wirksamen Kompromiss dar. Das Tätowieren ist im Vergleich zu anderen Techniken, wie z. B. Hautautotransplantaten, relativ einfach. Zu den weiteren Vorteilen gehören eine kleinere Lernkurve und eine relativ günstige Ausstattung. Das Tätowieren von Amphibien im Wasser bringt gewisse Herausforderungen mit sich, die Forscher einschüchtern und die erfolgreiche Tiermarkierung beeinträchtigen können. Diese Arbeit zielt darauf ab, Forschern gut dokumentierte Methoden zum Tätowieren von erwachsenen Xenopus mit einer rotierenden Tätowiermaschine an die Hand zu geben.