JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/67076
, , , , , ,
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience,Delft University of Technology, 2Chromosome Replication Laboratory,Francis Crick Institute, 3Department of Physics and Kavli Institute of Nanoscience Discovery,University of Oxford

Summary

אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לצלם ולכמת ישירות את התנועה של מנחת מסוקים Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) המסומן באופן פלואורסצנטי ומשוחזר במלואו על מולקולות דנ”א ליניאריות המוחזקות במקומן במלכודת אופטית.

Abstract

לאוקריוטים יש מנחת מסוקים משוכפל אחד המכונה CMG, אשר מארגן ומניע באופן מרכזי את הרפליזום, ומוביל את הדרך בחזית מזלגות השכפול. השגת הבנה מכניסטית עמוקה של הדינמיקה של CMG היא קריטית כדי להבהיר כיצד תאים משיגים את המשימה העצומה של שכפול יעיל ומדויק של כל הגנום שלהם פעם אחת בכל מחזור תא. טכניקות של מולקולות בודדות מתאימות באופן ייחודי לכימות הדינמיקה של CMG בשל הרזולוציה הטמפורלית והמרחבית שאין דומה לה. אף על פי כן, מחקרים על מולקולות בודדות של תנועת CMG הסתמכו עד כה על CMG שנוצר מראש מטוהר מתאים כמכלול, מה שמונע את חקר השלבים המובילים להפעלתו. כאן, אנו מתארים אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת שאפשרה הדמיה ברמת המולקולה הבודדת של התנועה של CMG המסומן באופן פלואורסצנטי לאחר שחזור מלא של הרכבתו והפעלתו מ-36 פוליפפטידים מטוהרים שונים של S. cerevisiae . בדיקה זו מסתמכת על הפונקציונליות הכפולה של הקצוות של מצע דנ”א ליניארי עם שני מויטי התקשרות אורתוגונליים, וניתן להתאים אותה לחקר מנגנוני עיבוד דנ”א מורכבים דומים ברמת המולקולה היחידה.

Introduction

שכפול DNA באיקריוטים מתבצע על ידי קומפלקס חלבונים דינמי המכונה replisome1. מרכיב מרכזי בקומפלקס זה הוא מנחת המסוקים המשוכפל האיקריוטי Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), המניע ומארגן באופן מרכזי את הרפליזום, ומוביל את הדרך בחזית מזלגות השכפול 1,2. השגת הבנה כמותית עמוקה של הדינמיקה של CMG היא אפוא קריטית להבנת הדינמיקה של הרפליזום. הבנה כזו יכולה להירכש באמצעות טכניקות של מולקולות בודדות, המתאימות באופן ייחודי לחקר מנועים מולקולריים, כגון CMG, בשל הרזולוציה המרחבית והרקתית שאין דומה לה, ויכולות לספק לנו הבנה כמותית שאין דומה לה של תפקודם, סטוכסטיותודינמיקה 2,3,4,5,6,7,8,9.

In vivo, CMG נטען ומופעל באופן מופרד זמנית כדי להבטיח שהשכפול יתרחש רק פעם אחת בכל מחזור תא 1,10,11. ראשית, בשלב G1 של מחזור התא, קבוצה של חלבונים הידועים כגורמי העמסה מעמיסה את המרכיב הראשון של CMG, קומפלקס הקסמרי Mcm2-7, על dsDNA 12,13,14,15,16 בצורה של הקסמרים כפולים עם תצורת ראש בראש 15,17,18 . במקרה הספציפי של שמרים, תהליך ראשוני זה מתרחש ברצפי דנ”א ספציפיים הידועים כמקורות השכפול1. למרות ש-Mcm2-7 הוא הליבה המוטורית של מנחת המסוקים המשוכפל, הוא כשלעצמו אינו מסוגל לשחרר את DNA19 ללא שני הגורמים המפעילים את הליקאז, Cdc45 ו-GINS, שיש לגייס ל-Mcm2-7 הטעון כדי ליצור CMG 11,19,20,21 פעיל במלואו. תהליך הפעלת מנחת המסוקים מתרחש בשלב S של מחזור התא ומתחיל עם זרחן סלקטיבי של Mcm2-7 hexamers כפול על ידי קינאז מווסת מחזור התא DDK 22,23,24. אירועי זרחן אלה מאפשרים גיוס של Cdc45 ו- GINS ל- Mcm2-7 Double hexamers 10,22,23,24,25,26 על ידי קבוצה שנייה של חלבונים הידועים כגורמי ירי 10,11,26. הקישור של Cdc45 ו- GINS מוליד שני מנחת מסוקים CMG אחות, אשר בתחילה תוחמים את שני גדילי ה- DNA ההורי ועדיין ממוקמים בתצורת ראש בראש11,27. בשלב ההפעלה האחרון, גורם הירי Mcm10 מזרז את האקסטרוזיה תלוית ההידרוליזה ATP של גדיל DNA אחד מכל אחות CMG11. לאחר שחול גדיל, מנחת המסוקים CMG האחות עוקפים ונפרדים זה מזה על ידי טרנסלוקציה לאורך ssDNA באופן תלוי ATP 11,20,21,28, ומשחררים DNA על ידי הרחקה סטרילית של גדיל29 שאינו טרנסלוקציה. כל התהליך הזה שוחזר במלואו במבחנה מקבוצה מינימלית של 36 פוליפפטידים מטוהרים של S. cerevisiae 10,11.

למרות הוויסות המעולה in vivo של הרכבה והפעלה של CMG שתואר לעיל, מחקרי תנועה במבחנה של מולקולה אחת של CMG 2,30,31,32,33,34 הסתמכו עד כה על CMG מופעל מראש שטוהר כקומפלקס מתאים20,21חסר את כל השלבים שקדמו להפעלתו ואת האופי הדו-כיווני של תנועתו., גישת CMG מופעלת מראש זו הייתה תקן הזהב בתחום המולקולה הבודדת, בין היתר בשל המורכבות הביוכימית של תגובת הרכבת CMG המשוחזרת במלואה10,11. תגובה ביוכימית זו הייתה מאתגרת לתרגום מהרמה הביוכימית בתפזורת לרמה של מולקולה בודדת מכמה סיבות. ראשית, כדי למקסם את יעילות התגובה, גורמי הטעינה והירי הדרושים להרכבה והפעלה של CMG נדרשים בריכוזים בטווח של 10-200 ננומטר10,11,27. טווחי ריכוז אלה תואמים את הקצה הגבוה של מה שרוב הטכניקות של מולקולה בודדת יכולות לסבול, במיוחד כאשר משתמשים ברכיבים המסומנים באופן פלואורסצנטי35. לבסוף, CMG התפתחה לשייט דרך אלפי זוגות בסיסים בתא 36,37,38,39. לכן, כדי לחקור את תנועתו בקנה מידה מרחבי רלוונטי ביולוגית, נדרשים מצעי דנ”א ארוכים (בדרך כלל באורכים בסדר גודל של עשרות קילו-בסיסים)30,31,34,40,41,42. שימוש במצעי דנ”א ארוכים כל כך מציב אתגר נוסף שככל שמצע הדנ”א ארוך יותר, כך יש לו יותר אתרי קישור פוטנציאליים לא ספציפיים לחלבונים ולאגרגטים חלבוניים. במקרה של CMG, הנקודה האחרונה חשובה במיוחד, מכיוון שכמה מגורמי הטעינה והירי המעורבים בהרכבה והפעלה של CMG מכילים אזורים לא מסודרים במהותם43 והם מועדים לצבירה.

כאן, אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת שאפשרה תצפית וכימות של תנועת CMG לאחר שחזור מלא של הרכבתו והפעלתו מ-36 פוליפפטידים מטוהרים של S. cerevisiae 28. בדיקה זו מסתמכת על התפקוד הכפול של שני הקצוות של מצע דנ”א עם שני מויטי התקשרות אורתוגונליים: desthiobiotin ו-digoxigenin2 (איור 1A). המויטי הראשון, desthiobiotin, משמש לקשירה הפיכה של מצע הדנ”א לחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין44 (איור 1B). לאחר מכן, CMG המסומן באופן פלואורסצנטי מורכב ומופעל על גבי הדנ”א הקשור לחרוזים, ומתלה מגנטי משמש לטיהור ולשטיפה של קומפלקסי הדנ”א:CMG הקשורים לחרוזים מגנטיים (איור 1C). בכך, מוסר עודפי החלבון שאחרת היו מצטברים על מצע הדנ”א; זה מספק קומפלקסים כמעט ללא צבירה:CMG. קומפלקסים שלמים מדוללים מהחרוזים המגנטיים על-ידי הוספה של עודף מולארי של ביוטין חופשי, שיכול להתחרות באינטראקציה דסתיביוטין-סטרפטאבידין (איור 1D). DNA בודד: קומפלקסים CMG קשורים בין שני חרוזי פוליסטירן לכודים אופטית המצופים בנוגדן אנטי-דיגוקסיגנין (anti-Dig); עבור השלב הזה, משתמשים במויטי השני בדנ”א, דיגוקסיגנין, מאחר שהוא יכול להיקשר לאנטי-דיג אפילו בתמיסת חיץ שמכילה עודף של ביוטין חופשי (איור 1E). ברגע שקומפלקס הדנ”א:CMG מוחזק במקומו במלכודת האופטית, התנועה של CMG המסומן באופן פלואורסצנטי מצולמת באמצעות לייזר סריקה קונפוקלי (איור 1F). אנו צופים כי בדיקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למחקר ברמת מולקולה אחת של אינטראקציות DNA:חלבון מורכבות דומות.

Protocol

1. סינתזה של מצע DNA ליניארי בעל תפקוד כפול וקשירה לחרוזים מגנטיים פונקציונליות כפולה של מצע DNA עם desthiobiotin ו digoxigenin moietiesלינאריות 20 מיקרוגרם של פלסמיד pGL50-ARS1 של 23.6 קילו-בתים (מכיל מקור ARS1 טבעי של שכפול, משובט בבית וזמין לפי בקשה) עם 200 יחידות של אנזים הגבלה AflII למשך 16 שעות ב-37°C בנפח סופי של 200 μL של חיץ 1x (50 מ”מ אשלגן אצטט, 20 מ”מ טריס-אצטט, 10 מ”מ מגנזיום אצטט, 100 מיקרוגרם/מ”ל BSA, pH 7.9).הערה: ניתן להפחית שלב זה ל -4 שעות מבלי להפחית את התפוקה, אם נוח יותר. השבתת AflII על ידי דגירה של התגובה ב 65 ° C למשך 20 דקות. הקהה את 4-נוקלאוטיד TTAA שנוצר על ידי השלמת תגובת ליניאריזציה של 200 μL עם 60 יחידות של Klenow Fragment (3′ עד 5′ exo-) פולימראז, 17 μL של חיץ 10x (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 7.9), 33 μM D-Desthiobiotin-7-dATP, 33 μM Digoxigenin-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, ומים אולטרה-טהורים עד לנפח סופי של 370 מיקרומטר. לדגור על התגובה ב-37°C למשך 30 דקות.הערה: בשלב זה, מקטע הקלנוב מקהה את התלויות בשני הקצוות של הדנ”א הליניארי על ידי שילוב שני נוקלאוטידים D-Desthiobiotin-7-dATP ושני נוקלאוטידים של Digoxigenin-11-dUTP בכל קצה. השלימו את התגובה עם 10 mM EDTA והשביתו את מקטע Klenow על ידי דגירה של התגובה ב-75°C למשך 20 דקות. הביאו את נפח התגובה ל-400 מיקרוליטר עם מים טהורים במיוחד. קח ארבעה עמודי סיבוב S-400, סובב אותם במשך 30 שניות לפחות כדי להשעות מחדש את השרף, ולאחר מכן צנטריפוגר אותם במשך דקה אחת ב 735 x גרם כדי להסיר את מאגר האחסון. העבר את העמודות לצינורות נקיים של 1.5 מ”ל. מיד, להוסיף 100 μL של תמיסת DNA לכל עמודה ולצנזר אותם במשך 2 דקות ב 735 x גרם. הדנ”א נמצא כעת בזרימה, והעמודות עשויות להיזרק החוצה. אגדו יחד את הזרימה של ארבעת העמודות, מדדו את הנפח עם פיפטה ומדדו את ריכוז הדנ”א באמצעות ספקטרופוטומטר. זה ישמש לחישוב כמות הדנ”א הקשור לחרוזים. קשירת DNA ליניארי בתפקוד כפול לחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידיןמערבולת M-280 חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין במשך 30 שניות כדי להשעות אותם מחדש. העבירו 4 מ”ג של חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין M-280 מרחפים לצינור נקי של 1.5 מ”ל. הניחו את הצינור במדף מגנטי, המתינו דקה אחת לאיסוף החרוזים והסירו את מאגר האחסון. הוסף 1 מ”ל של 1x חיץ A (5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA ו- 1 M NaCl) לחרוזים והשהה מחדש על ידי מערבולות במשך 5 שניות. דוגרים על החרוזים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.הערה: כל המאגרים צריכים להיות מסוננים סטריליים. הכינו מראש נפח גדול של 2x חיץ A, 1x buffer B (ראה להלן) ו-1x buffer C (ראה להלן) כדי לחסוך זמן (מומלץ). מאגרים אלה הם אלה המומלצים על ידי יצרן החרוזים המגנטיים וניתן לאחסן אותם ב – 20 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינור במחזיק מגנטי, ממתינים דקה לאיסוף החרוזים ומסירים את חיץ A. השהה מחדש את החרוזים ב 400 μL של 2x חיץ A על ידי pipetting, ולאחר מכן להוסיף 400 μL של תמיסת DNA פונקציונלית (שים לב כי זה מדלל את 2x חיץ A לריכוז סופי של 1x, שהוא אופטימלי עבור קישור DNA לחרוזים). מערבבים בעדינות על ידי פיפט. יש לדגור על תערובת החרוזים/דנ”א למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם סיבוב מקצה לקצה כדי לאפשר לדנ”א המתפקד להיקשר לחרוזים. השתמש במדף המגנטי כדי להסיר את הסופרנאטנט (אין להשליך לפני מדידת נפחו עם פיפטה ואת ריכוז הדנ”א הלא קשור באמצעות ספקטרופוטומטר) ולשטוף את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ B (10 mM HEPES-KOH pH 7.6, 1 mM EDTA ו- 1 M KOAc) כדי להסיר DNA שאינו קשור ספציפית. שטפו את החרוזים 2x עם 500 μL של חיץ C (10 mM HEPES-KOH pH 7.6 ו- 1 mM EDTA), שהוא מאגר האחסון המומלץ על ידי היצרן.חישוב הכמות הכוללת של דנ”א הקשור לחרוזים המגנטיים על ידי השוואת כמות הדנ”א הכוללת שנוספה לחרוזים עם כמות הדנ”א שנותרה בסופרנטנט. היבול צריך להיות בטווח של 2.3-2.9 מ”ג DNA (~ 150-190 fmol) לכל מ”ג של חרוזים מגנטיים. אם מתקבלות תפוקות נמוכות יותר, בדוק שעמודות S400 אינן יבשות לפני השימוש בהן. עקוב כל הזמן אחר שלמות ה- DNA על ידי אלקטרופורזה בג’ל כדי להבטיח שמצע ה- DNA הראשוני של פלסמיד אינו מפוזר. להשהות מחדש את החרוזים ב 300 μL של חיץ C ולאחסן ב 4 ° C. כדי למנוע ניקוי, לעשות 4 aliquots חד פעמי של 1 מ”ג של חרוזים מגנטיים, ולא לאחסן את ה- DNA במשך יותר מ 2 שבועות. 2. אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות ולכמת את התנועה של CMG משוחזר במלואו עם פינצטה אופטית דו-קרנית מתאמת ומיקרוסקופ קונפוקלי הרכבה והפעלה של CMG המסומן באופן פלואורסצנטי על גבי DNA הקשור לחרוזים מגנטיים (איור 1C).הערה: תגובות הרכבה והפעלה של CMG בוצעו בשני שלבים: טעינה וזרחון של Mcm2-7, והרכבה והפעלה של CMG. אלא אם כן צוין אחרת, כל שלבי החלפת החיץ בוצעו בעזרת מתלה מגנטי על ידי מתן אפשרות לאסוף את החרוזים על ידי המגנט למשך דקה אחת ולאחר מכן הסרת הסופרנטנט. כל הדגירות נערכו בבלוק חום מבוקר טמפרטורה עם מכסה למניעת הלבנה של חלבונים פלואורסצנטיים. אם מכסה אינו זמין, יש לכסות את הצינורות בנייר כסף. הטיהור והתיוג הפלואורסצנטי של כל החלבונים המשמשים בפרוטוקול זה בוצעו כפי שתואר קודם לכן10,11,28.העמסת MCM2-7 וזרחוןקח 1 מ”ג של חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין הקשורים ל- DNA והסר את מאגר האחסון (חיץ C). שטפו את החרוזים עם 200 מיקרוליטר של מאגר העמסה (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM K גלוטמט, 10 mM MgOAc, 0.02% NP40 substitute, 10% glycerol, 2 mM DTT, 100 μg/mL BSA ו-5 mM ATP). הסר את מאגר הטעינה והשהה מחדש את החרוזים ב- 75 מיקרוליטר של מאגר טעינה. מערבבים בעדינות על ידי פיפט. הוסף ORC בריכוז סופי של 37.5 ננומטר לדנ”א הקשור לחרוזים ודגור על התגובה במשך 5 דקות ב 30 ° C עם תסיסה של 800 סל”ד. הוסף Cdc6 בריכוז סופי של 50 ננומטר ודגור על התגובה במשך 5 דקות ב 30 ° C עם תסיסה 800 סל”ד. הוסף את Mcm2-7/Cdt1 (או מסומן באופן פלואורסצנטי Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1) בריכוז סופי של 100 ננומטר ודגור על התגובה במשך 20 דקות ב-30°C עם תסיסה של 800 סל”ד. הוסף DDK בריכוז סופי של 100 ננומטר ודגור על התגובה במשך 30 דקות ב 30 ° C עם תסיסה 800 סל”ד. הסר את הסופרנאטנט ושטוף את הדנ”א הקשור לחרוזים (המכיל כעת Mcm2-7 hexamers שעבר פוספורילציה) עם 200 μL של חיץ שטיפה עתיר מלח (HSW) (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0.02% NP40 substitute, 10% glycerol, 1 mM DTT ו- 400 μg/mL BSA). מערבבים על ידי פיפטטינג, ומבטיחים שהחרוזים תלויים מחדש במלואם בחיץ, ולא נראים גושים. הסר את מאגר HSW ושטוף את החרוזים פעם אחת עם 200 μL של מאגר CMG (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 250 mM K גלוטמט, 10 mM MgOAc, 0.02% NP40 תחליפי, 10% גליצרול, 1 mM DTT, ו 400 מיקרוגרם / מ”ל BSA). הרכבה והפעלה של CMG המסומן באופן פלואורסצנטיהסר את מאגר CMG והשהה מחדש את החרוזים הקשורים ל- DNA ב- 50 μL של מאגר CMG בתוספת 5 mM ATP. הוסף 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nm s-cdk, 50 nm Cdc45LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 ו- 10 nM Mcm10 ל- DNA הקשור לחרוזים. בשלב זה, ערבבו את כל החלבונים בצינור אחד מיד לפני הוספתם לדנ”א והניחו אותו על קרח. הוסיפו את הדנ”א המרחף הקשור לחרוזים לתערובת החלבונים. לדגור על התגובה במשך 15 דקות ב 30 ° C עם 800 סל”ד תסיסה. שטפו את החרוזים 3x עם 200 μL של חיץ HSW. שטפו את החרוזים פעם אחת עם 200 μL של חיץ CMG. אלוציה של קומפלקסים שלמים של דנ”א:CMG מחרוזים מגנטיים (איור 1D)הסר את חיץ CMG ומחק קומפלקסים של DNA:CMG מהחרוזים המגנטיים על ידי השעיה מחדש של החרוזים המגנטיים הקשורים ל- DNA המכילים CMG ב- 200 μL של חיץ אלוציה (מאגר CMG בתוספת ביוטין של 10 mM). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה עם תסיסה של 800 סל”ד. הניחו את הצינור במדף מגנטי ואפשרו לאסוף את החרוזים למשך 5 דקות. אספו בזהירות את הסופרנאטנט (המכיל כעת את קומפלקסי ה-DNA:CMG המדוללים) מבלי להפריע לחרוזים המיושבים והעבירו אותו לצינור חדש. כדי להבטיח שלא יישארו חרוזים בתמיסה (מכיוון שחרוזים מגנטיים שהושארו בתמיסה עלולים להפריע לחלק הלכידה האופטית של הבדיקה), הניחו את הסופרנאטנט שנאסף שוב במדף מגנטי ואפשרו לאסוף את כל החרוזים שנותרו במשך 5 דקות נוספות. בזהירות לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור חדש. הוסף 1400 μL של חיץ CMG ל 200 μL של supernatant. הדגימה מוכנה כעת להדמיית מולקולה בודדת. הדמיה של מולקולה בודדת של CMG משוחזר במלואו עם פינצטה אופטית בעלת אלומה כפולה ומיקרוסקופ קונפוקלי (איור 1E-ג).הערה: החלק של המולקולה הבודדת של הבדיקה מתבצע במערך מסחרי המשלב פינצטה אופטית בעלת אלומה כפולה עם מיקרוסקופ קונפוקלי ומיקרופלואידיקה45,46 (איור 1E-ג), אך יכול להתנהל גם במערך ביתי. המערך המסחרי המשמש כאן מצויד בתא זרימה מיקרופלואידי עם חמישה פתחים (המכונים תעלות 1-5, בהתאמה) ושקע אחד (איור 1E). בשלבים הבאים, כל שמות הלחצנים ו/או הפאנלים ספציפיים לתוכנה המסופקת עם התקנה מסחרית זו.השתמש בחמשת הפתחים במערך המסחרי באופן הבא: הזריק תעלות 1-3 משמאל והשתמש בהן ללכידת חרוזים (ערוץ 1), קשירת קומפלקס DNA-חלבון (ערוץ 2) ובדיקת נוכחות CMG (ערוץ 3). השתמשו בתעלות 4 ו-5 כמאגרי חלבונים וכמיקומי החלפת חיץ. לפני כל ניסוי, פסיב את תא הזרימה המיקרופלואידית במשך 30 דקות לפחות עם אלבומין בסרום בקר 1 מ”ג/מ”ל, ואחריו 0.5% F-127 פלורוני מומס במים טהורים במיוחד.ודא שהתוכן של כל ערוץ בכל ניסוי הוא כמתואר (איור 1E):ערוץ 1: חרוזי פוליסטירן מצופים אנטי-דיגוקסיגנין (קוטר 2.06 מיקרומטר) מדוללים 1:50 ב-PBS;ערוץ 2: DNA:קומפלקסים CMG מדוללים מחרוזים מגנטיים;ערוץ 3: חיץ הדמיה (חיץ CMG בתוספת 2 mM 1,3,5,7 cyclooctatetraene, 2 mM 4-nitrobenzylchohol, ו 2 mM Trolox);ערוצים 4 ו-5: מאגר הדמיה בתוספת RPA של 25 ננומטר, 10 ננומטר מקמ10, ו-5 מילימטר ATP, 5 מילימטר ATPγS, או ללא נוקלאוטידים. לפני הניסוי, כוונן את עוצמת לייזר ההשמנה כדי להשיג קשיחות של 0.3 pN/nm בשתי המלכודות33,46 על ידי לחיצה על כפתור כיול מחדש בחלונית Power Controls של התוכנה. הגדר את גודל הפיקסלים הקונפוקליים ל- 50 x 50 ננומטר, את גודל התמונה ל- 160 x 18 פיקסלים, את זמן ההארה לפיקסל ל- 0.2 אלפיות השנייה ואת קצב המסגרות ל- 5 שניות בחלונית סריקת התמונות של התוכנה. הגדר את בקרת הטמפרטורה ל- 30°C בחלונית Temperature.הערה: בנוסף, אנו ממליצים להגדיר את מהירות השלב המרבית (המשמשת למעבר בין ערוצים) ל- 0.2 מ”מ לשנייה כדי למזער את ניתוק CMG מה- DNA על ידי כוח הגרר. להזרים את כל התמיסות לתא הזרימה בלחץ קבוע של 0.5 בר בפתח ההזרקה (אותו ניתן להגדיר בלוח סרגל הלחץ של התוכנה). לאחר מכן, כבה את הזרימה בערוצים 4 ו -5. לאחר הזרמה ראשונית של כל התמיסות, להפחית את הלחץ ל 0.2 בר. העבר לייזרים לערוץ 1 עד שיילכד חרוז אחד בכל מלכודת אופטית. העבר חרוזים לכודים לערוץ 2 על ידי הזזת הג’ויסטיק תוך כדי לחיצה על ההדק. לאחר מכן, דגו קומפלקס DNA:CMG על ידי הזזת החרוז הימני לכיוון והרחק מהחרוז השמאלי באמצעות הג’ויסטיק מבלי ללחוץ על ההדק, עד שנלכד קשר DNA (הידוע על ידי ניטור עקומת הארכת הכוח של הדנ”אהלכוד 47 בחלונית FD Viewer של התוכנה).לצורך קשירת DNA, הקפד להזין את אורך הדנ”א ואת ערך הטמפרטורה הנכון בחלונית Reference Model, אשר תשרטט באופן אוטומטי מודל שרשרת תיאורטי דמוי תולעת מורחב של מבנה ה- DNA בחלונית FD Viewer. אם מולקולת דנ”א בודדת נתפסת בין שני החרוזים, התנהגות הארכת הכוח של הדנ”א צריכה להתאים מאוד למודל השרשרת דמוי התולעת המורחבת. ודא שזה המקרה על ידי ניטור עקומת הרחבת הכוח הניסיונית, שהתוכנה תתווה באופן אוטומטי על גבי זו התיאורטית.הערה: סטיות מהמודל התיאורטי יכולות להצביע על נוכחות של מולקולות דנ”א מרובות הקשורות בין החרוזים ו/או נוכחות של צברי חלבונים הקשורים לדנ”א ודחיסותו. כדי למנוע דיסוציאציה בתיווך כוח של חלבונים מהדנ”א, אין לחרוג ממתח של 10 pN במהלך בדיקה ראשונית זו. העבירו את החרוזים לערוץ 3 ועצרו מיד את הזרימה בכל הערוצים. בצע סריקת בדיקה של מסגרת אחת בערוץ 3 כדי לאשר את נוכחותו של CMG, המואר בלייזר של 561 ננומטר בהספק של 4 מיקרוואט כפי שנמדד במטרה. התאם את עוצמת הלייזר של ההדמיה בחלונית מדפסות לייזר עירור. אם הם קיימים, CMG יופיע ככתמים דו-ממדיים מוגבלים בעקיפה כפי שמוצג באיור 1G ובאיור 2A.אם לא ניתן לתפוס דנ”א, בדקו בערוץ 2 אם יש בועות, שיכולות להאט את הזרימה בערוץ 2 (בהשוואה לערוצים 1 ו-3). אם קיימות בועות, הגבירו את הלחץ בערוץ 2 עד 1 כדי לנסות לשטוף את הבועות דרכן. אם CMG קיים, העבר את קשירת הדנ”א לערוץ 4 או 5 לצורך הדמיה; אחרת, הפעל שוב את הזרימה, השליך את החרוזים וחזור לשלב 2.2.4. בתעלות 4 או 5, התאימו את המרחק בין החרוזים כדי להשיג מתח התחלתי של 2 pN בקשירה של הדנ”א. לשם כך, הזן 2 pN בחלונית ספקטרוסקופיית כוח ולחץ על כפתור הפעל כדי להפעיל מהדק כוח. ברגע שהמתח הראשוני מגיע ל-2 pN, השבת את מהדק הכוח לפני ההדמיה על ידי לחיצה על הלחצן Enable בחלונית Force Spectroscopy. תמונה: CMGCdc45-LD555 כל 5 שניות עם לייזר של 561 ננומטר בהספק של 4 מיקרוואט כפי שנמדד במטרה (איור 1F). לשם כך, לחץ על הלחצן Start Scan בחלונית Image Scan. בסריקות כאלה, CMG יופיע כנקודות דו-ממדיות מוגבלות עקיפה, כמו למשל באיור 1G.אם CMG נצפה אך לא נראה שהוא זז לפני ההלבנה, בדוק את כל החלבונים המשמשים לפעילות נוקלאז, שכן ניקים על הדנ”א יגרמו ל- CMG להתנתק מ- DNA41, מה שיפחית מאוד את התהליכיות הנראית לעין שלו.הערה: עוצמת לייזר של 4 μW אמורה לספק תוצאות עקביות אם משתמשים במיקרוסקופ המסחרי המשמש כאן. אם משתמשים במערך בנייה ביתית, אנו ממליצים להעריך את עוצמת הלייזר האופטימלית באופן אמפירי. עוצמת לייזר אופטימלית אמורה לתת מספיק אות מהפלואורופור כדי למקם אותו בדיוק הרצוי, ואורך חיים פלואורופור קרוב לטווח הזמן הרצוי של הניסוי.הערה: למרות שפרסום זה מתמקד בהרכב היברידי ובניסוי של מולקולה בודדת, פרסמנו בעבר תיאור מקיף של ניתוח הנתונים שנוצרו עם בדיקה זו48.

Representative Results

כאשר הוא מבוצע כראוי, הפרוטוקול המתואר כאן אמור להניב קומפלקסים כמעט נטולי צבירה של DNA:CMG. תגובה נטולת צבירה לא אמורה לסתום אף אחת מהתעלות בתא הזרימה המיקרופלואידית, ואמורה להיות אפשרות למתוח את מולקולות הדנ”א הכלואות להארכה מקצה לקצה בתוך 10% מאורך קווי המתאר שלה מבלי לשבור את הדנ”א. לעומת זאת, אם יש צבירה בתגובה, מולקולות דנ”א עשויות לפעמים להידחס על ידי הצברים, ולעתים קרובות לגרום לשבירת דנ”א אם הן נמתחות. דרך טובה לזהות צברי חלבונים היא על ידי התבוננות בסריקות הדו-ממדיות של הדנ”א. בתגובה נטולת צבירה, CMG מופיע כנקודות בדידות וסימטריות מוגבלות בעקיפה שגודשות בדלילות את הדנ”א, כמו אלה שבסריקות שמוצגות באיור 2A. להיפך, הצברים הם פחות בדידים, לפעמים כתמים א-סימטריים שמצטופפים לאורך גדול יותר של הדנ”א, כמו אלה שבסריקות שמוצגות באיור 2B. יתר על כן, אם הבדיקה מבוצעת בהצלחה, וטוהר גבוה של החלבונים המטוהרים מושג, תנועה ארוכת טווח של CMG בנוכחות ATP תיראה, כפי שנצפה בקימוגרף המוצג באיור 2C. איור 1: תיאור ציורי של אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות ולכמת את התנועה של CMG משוחזר במלואו. (A) דנ”א ליניארי של 23.6 קילו-בתים המכיל מקור ARS1 טבעי של שכפול מתפקד באופן כפול בשני הקצוות עם מואיטים של דסתיוביוטין ודיגוקסיגנין. (B) דנ”א מתפקד כפליים קשור לחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין דרך ה-desthiobiotin moieties שלו. (C) CMG מורכב ומופעל בהדרגה על הדנ”א הקשור לחרוזים מגנטיים עם שלבי שטיפה שונים הכלולים כדי להסיר עודפי חלבון וצברי חלבונים לא קשורים. (D) דנ”א שלם: קומפלקסים של CMG מדוללים אז מהחרוזים המגנטיים על ידי תוספת של עודף ביוטין חופשי, אשר מתחרה באינטראקציה desthiobiotin-streptavidin. (E) קומפלקסים בודדים של דנ”א:CMG קשורים בין שני חרוזי פוליסטירן מצופים אופטית נגד דיגוקסיגנין בעזרת תא זרימה מיקרופלואידי. שימו לב שהאינטראקציה Dig-anti-Dig היא אורתוגונלית לאינטראקציות ביוטין-אבידין, ולכן היא אינה מושפעת מנוכחות ביוטין חופשי. (F) לאחר שהוחזקו במקומם על ידי הפינצטה האופטית, קומפלקסים של DNA:CMG מועברים לתנאי חיץ שונים, שבהם מישור הדנ”א נסרק באמצעות לייזר סורק קונפוקלי כדי לצלם את תנועת CMG לאורך הדנ”א לאורך זמן. (G) הלוח העליון מציג דיאגרמה של קומפלקס DNA:CMG המוחזק במקומו בין שני חרוזי פוליסטירן מצופים אנטי-דיג לכודים אופטית שנסרקים על ידי לייזר סריקה קונפוקלי. הלוח התחתון מציג סריקה דו-ממדית לדוגמה של CMG הקשור לדנ”א המוחזק במקום באמצעות מלכודת אופטית. הדנ”א אינו מסומן בניסויים אלה, אך ניתן לחשוב עליו כעל קו אופקי העובר במרכז התמונה. נתון זה שונהמ-28. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: דוגמאות לנתונים מניסוי מוצלח ומניסוי כושל. (A) סריקות דו-ממדיות לדוגמה של דנ”א המכיל CMG בדגימה נטולת צבירה. בשתי הסריקות, CMG מראה כתמים סימטריים ובדידים מוגבלי עקיפה המפוזרים בדלילות לאורך הדנ”א. (B) סריקות דו-ממדיות לדוגמה של דנ”א המכיל CMG בדגימה המכילה אגרגטים. בשתי הסריקות, CMG יוצר כתמים פחות סימטריים המצטופפים בדנ”א. (C) קימוגרף המראה את המיקום על הדנ”א של נקודות מוגבלות עקיפה CMG לאורך זמן בנוכחות ATP, מראה את התנועה ארוכת הטווח של קומפלקסים CMG. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שלבים קריטיים ובדיקות איכות ריאגנטים חשובות
השלבים הקריטיים ובדיקות האיכות של מגיב ביולוגי בבדיקה מודגשים כאן. ראשית, טוהר החלבונים בהם נעשה שימוש חשוב מכיוון שהתפרקות הדנ”א הנגרמת אפילו על ידי מזהמי נוקלאז קטנים בדגימות החלבון תשפיע לרעה על הנתונים. הסיבה לכך היא שרק מולקולות דנ”א שלמות (או חלקיות) יכולות להילכד בפינצטה האופטית בעלת האלומה הכפולה. חשוב מכך, ניקים בדנ”א יגרמו ל-CMG לנתק41, מה שיסבך את התצפית על התנועה ארוכת הטווח של CMG. אנו ממליצים בחום לבדוק כל חלבון מטוהר לפעילות הנוקלאז, כמו גם לעקוב באופן קבוע אחר שלמות מצע הפלסמיד ההתחלתי כדי להבטיח שהניקינג מצטמצם למינימום. השלב החשוב השני הוא הסרה זהירה של החרוזים המגנטיים בעקבות ההדחה של מתחמי DNA:CMG. הסרת סופרנטנט בשלב זה צריכה להתבצע לאט כדי לא להפריע לחרוזים שנאספו. אם חרוזים מגנטיים נשארים בדגימה המוטסת לפינצטה האופטית, הם לרוב יפגעו בחרוזי הפוליסטירן הכלואים אופטית, מה שיגרום להם להימלט מהמלכודת האופטית ויסבך את איסוף הנתונים. לבסוף, יש לטפל בזהירות בקומפלקסים של DNA:CMG בפינצטה האופטית. לשם כך, אנו ממליצים לא להגדיל את המתח של הדנ”א מעל 10 pN, שכן הפעלת כוח עלולה לנתק CMG מהדנ”א. יתר על כן, המעבר בין תעלות בתא הזרימה המיקרופלואידית צריך להיעשות לאט ככל האפשר (~ 0.2 מ”מ לשנייה) כדי למנוע מכוחות הגרר המתקבלים לנתק CMG מהדנ”א.

שינויים בשיטה
ישנם מספר שלבים של הבדיקה שניתן לשנות. לדוגמה, הראינו כי ניתן לקצר את זמן האלוציה מ-60 דקות ל-30 דקות מבלי להשפיע באופן משמעותי על תפוקת האלוציה. בנוסף, אנו ממליצים להשלים את מאגר האלוציה עם ריכוז נמוך (מתחת ל-1 מילימטר) של ATP או ATPγS כדי למנוע מ-CMG להתפזר מקצות הדנ”א, כמו גם לייצב באופן כללי את CMG28. יתר על כן, למרות שהרכבי החיץ וריכוזי החלבונים שאנו מדווחים עליהם כאן מבוססים על אלה ששימשו בעבודה ביוכימית וחד-מולקולה קודמת11,18, הבדיקה שאנו מתארים תואמת לחלוטין לפרוטוקולים אחרים להרכבת CMG26,27. לכן, כל התקדמות ביוכימית המדווחת כמגבירה את יעילות ההרכבה או ההפעלה של CMG יכולה וצריכה להיות מיושמת בחלק הארי של הבדיקה כדי להגדיל את התשואה. לבסוף, הגדלת הזמן בין מסגרות מגדילה את הזמן הכולל שבו CMG ניתן לצלם, להקל על התצפית של תנועת CMG לטווח ארוך לפני הלבנה פלואורופור.

מגבלות השיטה
השיטה ההיברידית שאנו מתארים מוגבלת בכך שניתן לדמיין CMG רק לאחר הפעלתו בכמויות גדולות. עבודה נוספת תידרש כדי לצפות בהפעלת CMG בזמן אמת. מגבלה חשובה נוספת היא שבעוד שאנו מצפים ש-CMG יורכב בזוגות 17,26,27, המספר הכולל של קומפלקסים של CMG לכל דנ”א שאנו רואים הוא בעיקר אחד 28, מה שמרמז על כך ש-CMG, או לפחות Cdc45, מתנתק מהדנ”א במהלך הטיפול בקומפלקסים הרגישים של DNA:CMG. הפחתת מספר שלבי הטיפול לפני הדמיה של מולקולה בודדת, כמו גם פיתוח אסטרטגיות פסיבציה טובות יותר עבור צינורות הפלסטיק והזכוכית של תא הזרימה המיקרופלואידית צפויים להגדיל תפוקה זו.

משמעות השיטה
מחקרי תנועה של מולקולות בודדות של CMG השתמשו עד כה ב-CMG מופעל מראש שטוהר כקומפלקס מתאים (complex from cells). למרות שהיא פשוטה יחסית, גישת CMG מופעלת מראש זו מוגבלת בכך שהיא מפספסת את כל השלבים המובילים להפעלת CMG, כמו גם את האופי הדו-כיווני של CMG ותנועה רפליזומית. מצד שני, להרכבה מחדש מלאה של הרכבה והפעלה של CMG יש פוטנציאל ללמוד כל שלבי קדם-הפעלה, כמו גם ללמוד תנועת CMG באופן דו-כיווני. עם זאת, קשה יותר לתרגם גישה זו מהרמה הביוכימית בתפזורת לרמה של מולקולה בודדת, מכיוון שהיא כוללת הרבה יותר גורמים ושלבים חלבוניים מטוהרים. הבדיקה שאנו מתארים כאן סייעה להתגבר על אתגרים אלה בכך שאפשרה לנו לדמיין את התנועה של CMG משוחזר במלואו ברמת המולקולה היחידה, ואפשרה לנו לגשת לכמה דינמיקות קדם-הפעלה שהוחמצו קודם לכן28. בנוסף, אף על פי שאנו רואים בעיקר CMG אחד לכל דנ”א, הצלחנו לצפות בכמה מקרים של שני קומפלקסים של CMG הנעים בכיוונים מנוגדים, ויכולנו אפילו ללכוד את ההפרדה הראשונית של CMG אחות זו מזו28, מה שסיפק כמה תובנות לגבי ביסוס השכפול הדו-כיווני.

יתרון נוסף של הבדיקה הזו בהשוואה לתנועת CMG קודמת טמון באופי הדו-גדילי המלא של מצע הדנ”א שאנו משתמשים בו (איור 1A). בעבודות CMG קודמות שהופעלו מראש, הדרך הנפוצה ביותר לקשור CMG למצע הדנ”א היא באמצעות דש ssDNA 3′. התוצאה היא מבנה דנ”א שלא ניתן להגביל אותו בקלות ולכן אוסר על חקר התפקיד של סליל-על בהתקדמות השחזור. לעומת זאת, הגישה החדשה שאנו מתארים כאן עשויה להיות מותאמת לחקר תפקיד המומנט בתהליך זה, שכן מצע הדנ”א המשמש הוא דו-גדילי לחלוטין.

יישומים רחבים יותר של השיטה
המבחן ההיברידי המתואר יסלול את הדרך לבנייה מחדש מלאה של רפליזום אאוקריוטי שלם, ויאפשר לנו ולאחרים להתבונן ולכמת את הדינמיקה החשובה המאפשרת לרפליזום להצליח בכל משימותיו השונות. מלבד שכפול דנ”א, הבדיקה שאנו מדווחים עליה מייצגת התקדמות חשובה בתרגום תגובה ביוכימית מורכבת מרמת הביוכימיה בתפזורת לרמת המולקולה הבודדת. אנו צופים שניתן יהיה לשנות בקלות בדיקה זו כדי לחקור אינטראקציות DNA:חלבונים מורכבות דומות המעורבות במנגנוני עיבוד DNA שונים.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לאן ארלי, לוסי דרורי ומקס דאגלס על אספקת זני שמרים לביטוי יתר של חלבונים לא מסומנים, כמו גם לחברי המעבדה של N.D. אנוג’ קומאר, קטינקה ליגטהארט וג’וליאן גרוס על עזרתם בטיהור גורמי העמסה ו-DDK. המחברים מודים גם לקיילי מק’קלוסקי, דוריאן מיקולאיצ’אק, ג’וזף יילס, ג’ייקוב לואיס, אלסנדרו קוסטה, חסן ירדיצ’י וטאקג’יפ הא על דיונים מדעיים מועילים. ד.ר.מ. מודה במימון ממלגת Boehringer Ingelheim Fonds PhD Fellowship.  N.D. מכירה במימון מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) באמצעות מענק עליון 714.017.002 וממועצת המחקר האירופית באמצעות מענק מתקדם (REPLICHROMA; מענק מספר 789267).

Materials

AflII  NEB R0520L
Anti-digoxigenin coated polystyrene beads  Spheroteck DIGP-20-2
ATP solution Thermo Fisher R0441
ATPγS Roche 11162306001
BSA NEB B9000S
C-Trap Lumicks
CutSmart Buffer NEB B6004S Provided with AflII
dCTP Promega U122B
D-Desthiobiotin-7-dATP Jena Bioscience  NU-835-Desthiobio
dGTP Thermo Fisher 10218014
Digoxigenin-11-dUTP Jena Bioscience NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads Invitrogen 11205D
Klenow Fragment (3'→5' exo-)  NEB M0212L
Microspin S-400 HR spin columns  GE Healthcare GE27-5140-01
NEBuffer2 NEB B7002S Provided with Klenow Fragment
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385
Pluronic F-127  Sigma P2443
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetik. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase. Nat Commun. 10 (1), 1-14 (2019).
  3. Ticau, S., Friedman, L. J., Ivica, N. A., Gelles, J., Bell, S. P. Single-molecule studies of origin licensing reveal mechanisms ensuring bidirectional helicase loading. Cell. 161 (3), 513-525 (2015).
  4. Ticau, S., et al. Mechanism and timing of Mcm2-7 ring closure during DNA replication origin licensing. Nat Str Mol Biol. 24 (3), 309-315 (2017).
  5. Gupta, S., Friedman, L. J., Gelles, J., Bell, S. P. A helicase- tethered ORC flip enables bidirectional helicase loading. eLife. 10, e74282 (2021).
  6. Lewis, J. S., et al. Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).
  7. Dulin, D., Berghuis, B. A., Depken, M., Dekker, N. H. Untangling reaction pathways through modern approaches to high-throughput single-molecule force-spectroscopy experiments. Curr Opinion Str Biol. 34, 116-122 (2015).
  8. Lewis, J. S., van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines. Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).
  9. Abbondanzieri, E. A., Greenleaf, W. J., Shaevitz, J. W., Landick, R., Block, S. M. Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase. Nature. 438 (7067), 460-465 (2005).
  10. Yeeles, J. T. P., Deegan, T. D., Janska, A., Early, A., Diffley, J. F. X. Regulated eukaryotic DNA replication origin firing with purified proteins. Nature. 519 (7544), 431-435 (2015).
  11. Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation. Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).
  12. Remus, D., et al. Concerted loading of Mcm2-7 double hexamers around DNA during DNA replication origin licensing. Cell. 139 (4), 719-730 (2009).
  13. Frigola, J., Remus, D., Mehanna, A., Diffley, J. F. X. ATPase-dependent quality control of DNA replication origin licensing. Nature. 495 (7441), 339-343 (2013).
  14. Coster, G., Frigola, J., Beuron, F., Morris, E. P., Diffley, J. F. X. Origin licensing requires ATP binding and hydrolysis by the MCM replicative helicase. Mol Cell. 55 (5), 666-677 (2014).
  15. Coster, G., Diffley, J. F. X. Bidirectional eukaryotic DNA replication is established by quasi-symmetrical helicase loading. Science. 357 (6348), 314-318 (2017).
  16. Miller, T. C. R., Locke, J., Greiwe, J. F., Diffley, J. F. X., Costa, A. Mechanism of head-to-head MCM double-hexamer formation revealed by cryo-EM. Nature. 575 (7784), 704-710 (2019).
  17. Abid Ali, F., et al. Cryo-EM structure of a licensed DNA replication origin. Nat Commun. 8 (1), 1-10 (2017).
  18. Sánchez, H., et al. DNA replication origins retain mobile licensing proteins. Nat Commun. 12 (1), 1908 (2021).
  19. Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins. Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).
  20. Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).
  21. Langston, L. D., et al. CMG helicase and DNA polymerase ε form a functional 15-subunit holoenzyme for eukaryotic leading-strand DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (43), 15390-15395 (2014).
  22. Sheu, Y. J., Stillman, B. Cdc7-Dbf4 phosphorylates MCM proteins via a docking site-mediated mechanism to promote S phase progression. Mol Cell. 24 (1), 101-113 (2006).
  23. Sheu, Y. J., Stillman, B. The Dbf4-Cdc7 kinase promotes S phase by alleviating an inhibitory activity in Mcm4. Nature. 463 (7277), 113-117 (2010).
  24. Randell, J. C. W., et al. Mec1 is one of multiple kinases that prime the Mcm2-7 helicase for phosphorylation by Cdc7. Mol Cell. 40 (3), 353-363 (2010).
  25. Greiwe, J. F., et al. Structural mechanism for the selective phosphorylation of DNA-loaded MCM double hexamers by the Dbf4-dependent kinase. Nat Str Mol Biol. 29 (1), 10-20 (2021).
  26. de Jesús-Kim, L., Friedman, L. J., Ramsoomair, C., Gelles, J., Bell, S. P. DDK regulates replication initiation by controlling the multiplicity of Cdc45-GINS binding to Mcm2-7. eLife. 10, e65471 (2021).
  27. Lewis, J. S., et al. Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly. Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).
  28. Ramírez Montero, D., et al. Nucleotide binding halts diffusion of the eukaryotic replicative helicase during activation. Nat Commun. 14 (1), 2082 (2023).
  29. Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model. Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).
  30. Lewis, J. S., et al. Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).
  31. Lewis, J. S., et al. Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication. Mol Cell. 77, 1-9 (2020).
  32. Schauer, G. D., et al. Replisome bypass of a protein-based R-loop block by Pif1. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (48), 30354-30361 (2020).
  33. Wasserman, M. R., Schauer, G. D., O’Donnell, M. E., Liu, S. Replication fork activation is enabled by a single-stranded DNA gate in CMG helicase. Cell. 178 (3), 600-611.e16 (2019).
  34. Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase. Nat Commun. 11 (1), 1-15 (2020).
  35. White, D. S., Smith, M. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Strategies for overcoming the single-molecule concentration barrier. ACS Meas Sci Au. 3 (4), 239-257 (2023).
  36. Liachko, I., et al. A comprehensive genome-wide map of autonomously replicating sequences in a naive genome. PLoS Genet. 6 (5), 22 (2010).
  37. Kapadia, N., et al. Processive activity of replicative DNA polymerases in the replisome of live eukaryotic cells. Mol Cell. 80 (1), 114-126.e8 (2020).
  38. Claussin, C., Vazquez, J., Whitehouse, I. Single-molecule mapping of replisome progression. Mol Cell. 82 (7), 1372-1382.e4 (2022).
  39. Polo Rivera, C., Deegan, T. D. Replicon-seq: seeing is believing. Trends Genet. 38 (10), 987-988 (2022).
  40. Sparks, J. L., et al. The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair. Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).
  41. Vrtis, K. B., et al. Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly. Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).
  42. Low, E., Chistol, G., Zaher, M. S., Kochenova, O. V., Walter, J. C. The DNA replication fork suppresses CMG unloading from chromatin before termination. Genes Dev. 34 (21), 1534-1545 (2020).
  43. Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. eLife. 8, 1-35 (2019).
  44. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  45. Candelli, A., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Phys Chem Chem Phys. 13 (16), 7263-7272 (2011).
  46. Candelli, A., et al. Visualization and quantification of nascent RAD51 filament formation at single-monomer resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15090-15095 (2014).
  47. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, S. Entropic elasticity of lambda-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  48. Liu, Z., et al. A biophysics toolbox for reliable data acquisition and processing in integrated force-confocal fluorescence microscopy. ACS Photonics. 11 (4), 1592-1603 (2024).

Tags

Hybrid EnsembleSingle-molecule AssayCMG HelicaseReplisome DynamicsGenome ReplicationTemporal ResolutionSpatial ResolutionFluorescent LabelingS. Cerevisiae PolypeptidesDNA-processing Mechanisms
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Ramírez Montero, D., Sánchez, H., van Veen, E., van Laar, T., Solano, B., Diffley, J. F. X., Dekker, N. H. Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG. J. Vis. Exp. (209), e67076, doi:10.3791/67076 (2024).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image