杂交集合和单分子检测对完全重构的 CMG 的运动进行成像

1. 合成双功能化线性 DNA 底物并与磁珠结合 DNA 底物与脱硫生物素和地高辛部分的双重功能化在 37 °C 下，用 200 单位限制性内切酶 AflII 线性化 20 μg 23.6 kb 质粒 pGL50-ARS1（包含天然 ARS1 复制起点，内部克隆，可根据要求提供）在 37 °C 下，终体积为 200 μL 1x 缓冲液（50 mM 乙酸钾、20 mM Tris-乙酸钠、10 mM 乙酸镁、 100 μg/ml BSA，pH 7.9）。注意：如果更方便，此步骤可以减少到 4 小时而不降低产量。 通过在 65 °C 下孵育反应 20 分钟来灭活 AflII。通过在 200 μL 线性化反应中补充 60 单位的 Klenow 片段（3′ 至 5′ 外切）聚合酶、17 μL 10x 缓冲液（500 mM NaCl、100 mM Tris-HCl、100 mM MgCl2、10 mM DTT，pH 7.9）、33 μM D-脱硫生物素-7-dATP、33 μM 地高辛-11-dUTP、33 μM dCTP、33 μM dGTP、 和超纯水至终体积为 370 μM。将反应物在 37 °C 下孵育 30 分钟。注：在此步骤中，Klenow 片段通过在两端掺入两个 D-脱硫生物素-7-dATP 和两个地高辛-11-dUTP 核苷酸来减弱线性化 DNA 两端的突出端。 用 10 mM EDTA 补充反应物，并在 75 °C 下孵育反应物 20 分钟来灭活 Klenow 片段。用超纯水使反应体积达到 400 μL。 取四个 S-400 离心柱，涡旋至少 30 秒以重悬树脂，然后以 735 x g 离心 1 分钟以去除储存缓冲液。将色谱柱转移至干净的 1.5 mL 试管中。 立即向每根柱中加入 100 μL DNA 溶液，并以 735 x g 的离心力离心 2 分钟。DNA 现在在流出液中，色谱柱可能会被丢弃。 汇集四根色谱柱的流出液，用移液管测量体积，用分光光度计测量 DNA 浓度。这将用于计算与珠子结合的 DNA 量。 将双功能化线性 DNA 与链霉亲和素包被的磁珠结合涡旋 M-280 链霉亲和素包被的磁珠 30 秒以使其重悬。 将 4 mg 重悬的 M-280 链霉亲和素包被的磁珠转移到干净的 1.5 mL 试管中。将试管放在磁架上，等待 1 分钟以收集珠子，然后取出储存缓冲液。 向珠子中加入 1 mL 的 1x 缓冲液 A（5 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5 mM EDTA 和 1 M NaCl），涡旋重悬 5 秒。将珠子在室温下孵育 5 分钟。注：所有缓冲液均应无菌过滤。预先制备大量 2x 缓冲液 A、1x 缓冲液 B（见下文）和 1x 缓冲液 C（见下文）以节省时间（推荐）。这些缓冲液是磁珠制造商推荐的缓冲液，可以储存在 – 20°C 下。 将试管放入磁性支架中，等待 1 分钟以收集珠子，然后去除缓冲液 A。 通过移液将磁珠重悬于 400 μL 的 2x 缓冲液 A 中，然后加入 400 μL 功能化 DNA 溶液（请注意，这会将 2x 缓冲液 A 稀释至 1x 的最终浓度，这是 DNA 与磁珠结合的最佳选择）。通过移液轻轻混合。 将磁珠/DNA 混合物在 4 °C 下孵育过夜，并端到端旋转，以使功能化的 DNA 与磁珠结合。 使用磁力架去除上清液（在用移液管测量其体积和用分光光度计测量未结合 DNA 的浓度之前不要丢弃），并用 500 μL 缓冲液 B（10 mM HEPES-KOH pH 7.6、1 mM EDTA 和 1 M KOAc）洗涤珠子 2 次，以去除非特异性结合的 DNA。用 500 μL 缓冲液 C（10 mM HEPES-KOH pH 7.6 和 1 mM EDTA）洗涤珠子 2 次，这是制造商推荐的储存缓冲液。通过将添加到磁珠中的 DNA 总量与上清液中剩余的 DNA 量进行比较，计算与磁珠结合的 DNA 总量。产量应在每 mg 磁珠 2.3-2.9 mg DNA （~150-190 fmol） 的范围内。如果获得的产量较低，请在使用前检查 S400 色谱柱是否未干燥。通过凝胶电泳持续监测 DNA 完整性，以确保初始质粒 DNA 底物不被降解。 将珠子重悬于 300 μL 缓冲液 C 中，并储存在 4 °C 下。 为防止切口，将 1 mg 磁珠制成 4 次一次性等分试样，并且 DNA 的储存时间不要超过 2 周。 2. 混合集成和单分子分析，使用相关双光束光镊和共聚焦显微镜对完全重组的 CMG 的运动进行成像和量化 荧光标记的 CMG 在磁珠结合 DNA （图 1C).注：CMG 组装和活化反应分两个阶段进行：Mcm2-7 上样和磷酸化，以及 CMG 组装和活化。除非另有说明，否则所有缓冲液更换步骤均在磁架的帮助下进行，让磁珠被磁力架收集 1 分钟，然后去除上清液。所有孵育均在带盖的温控加热块中进行，以防止荧光蛋白发生光漂白。如果没有盖子，则应用锡箔纸覆盖管子。该方案中采用的所有蛋白质的纯化和荧光标记已如前所述进行10,11,28.Mcm2-7 负载和磷酸化取 1 mg DNA 结合的链霉亲和素包被的磁珠，并去除储存缓冲液（缓冲液 C）。 用 200 μL 上样缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6、100 mM K 谷氨酸、10 mM MgOAc、0.02% NP40 替代品、10% 甘油、2 mM DTT、100 μg/mL BSA 和 5 mM ATP）洗涤珠子。 去除上样缓冲液，并将磁珠重悬于 75 μL 上样缓冲液中。通过移液轻轻混合。 向微珠结合的 DNA 中加入终浓度为 37.5 nM 的 ORC，并在 30 °C 下以 800 rpm 的转速搅拌孵育反应 5 分钟。 加入终浓度为 50 nM 的 Cdc6，并在 30 °C 下以 800 rpm 的搅拌孵育反应 5 分钟。 加入终浓度为 100 nM 的 Mcm2-7/Cdt1（或荧光标记的 Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1），并在 30 °C 下以 800 rpm 的搅拌孵育反应 20 分钟。 加入终浓度为 100 nM 的 DDK，并在 30 °C 下以 800 rpm 的搅拌孵育反应 30 分钟。 去除上清液，用 200 μL 高盐洗涤 （HSW） 缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6、300 mM KCl、10 mM MgOAc、0.02% NP40 替代品、10% 甘油、1 mM DTT 和 400 μg/mL BSA）洗涤珠子结合的 DNA（现在含有磷酸化的 Mcm2-7 六聚体）。通过移液混匀，确保微珠完全重悬于缓冲液中，并且看不到团块。 去除 HSW 缓冲液，并用 200 μL CMG 缓冲液（25 mM HEPES-KOH pH 7.6、250 mM K 谷氨酸、10 mM MgOAc、0.02% NP40 替代品、10% 甘油、1 mM DTT 和 400 μg/mL BSA）洗涤珠子一次。 荧光标记的 CMG 的组装和激活去除 CMG 缓冲液，将 DNA 结合的珠子重悬于 50 μL 补充有 5 mM ATP 的 CMG 缓冲液中。 向微珠结合的 DNA 中添加 50 nM Dpb11、200 nM GINS、30 nM Polɛ、20 nM S-CDK、50 nM Cdc45LD555、30 nM Sld3/7、55 nM Sld2 和 10 nM Mcm10。对于此步骤，在将它们添加到 DNA 中之前，立即将所有蛋白质混合在一个试管中并将其置于冰上。将重悬的微珠结合 DNA 添加到蛋白质混合物中。将反应物在 30 °C 下以 800 rpm 搅拌孵育 15 分钟。 用 200 μL HSW 缓冲液洗涤珠子 3 次。用 200 μL CMG 缓冲液洗涤珠子一次。 从磁珠中洗脱完整 DNA：CMG 复合物（图 1D）通过将含有 CMG 的 DNA 结合磁珠重悬于 200 μL 洗脱缓冲液（补充有 10 mM 生物素的 CMG 缓冲液）中，去除 CMG 缓冲液并从磁珠中洗脱 DNA：CMG 复合物。在室温下以 800 rpm 搅拌孵育 1 小时。 将试管放在磁架上，让珠子收集 5 分钟。小心收集上清液（现在包含洗脱的 DNA：CMG 复合物），不要破坏沉淀的微珠，并将其转移到新试管中。 为确保溶液中没有磁珠残留（因为残留在溶液中的磁珠会干扰分析的光捕获部分），请将收集的上清液再次放入磁架中，并让任何剩余的磁珠再收集 5 分钟。小心收集上清液并将其转移到新试管中。 向 200 μL 上清液中加入 1400 μL CMG 缓冲液。样品现在可用于单分子成像。 使用相关双光束光镊和共聚焦显微镜 （图 1E-G).注：测定的单分子部分在商业设置中进行，该设置将双光束光镊与共聚焦显微镜和微流体相结合45,46 (图 1E-G），但也可以在自建设置中进行。这里使用的商业装置配备了一个微流体流通池，该流通池具有五个入口（分别称为通道 1-5）和一个出口 （图 1E).在以下步骤中，所有按钮和/或面板名称都特定于此商业设置随附的软件。在商业设置中使用五个入口，如下所示：从左侧注入通道 1-3，并将其用于微珠捕获（通道 1）、DNA-蛋白质复合物结合（通道 2）和检查 CMG 的存在（通道 3）。使用通道 4 和 5 作为蛋白质储液库和缓冲液交换位置。每次实验前，用 1 mg/mL 牛血清白蛋白钝化微流体流动池至少 30 分钟，然后用 0.5% Pluronic F-127 溶解在超纯水中。确保每个实验中每个通道的内容如前所述（图 1E）：通道 1：在 PBS 中以 1：50 稀释的抗地高辛包被的聚苯乙烯微珠（直径 2.06 μm）;通道 2：DNA：从磁珠中洗脱的 CMG 复合物;通道 3：成像缓冲液（补充有 2 mM 1,3,5,7 环辛四烯、2 mM 4-硝基苄基醛酚和 2 mM Trolox 的 CMG 缓冲液）;通道 4 和 5：补充有 25 nM RPA、10 nM Mcm10 和 5 mM ATP、5 mM ATPγS 或无核苷酸的成像缓冲液。 在实验之前，通过单击软件“功率控制”面板中的“重新校准”按钮，调整捕获激光功率，以在两个陷阱 33,46 中实现 0.3 pN/nm 的刚度。在软件的“图像扫描”面板中，将共聚焦像素大小设置为 50 x 50 nm，图像大小设置为 160 x 18 像素，每个像素的照明时间设置为 0.2 毫秒，帧速率设置为 5 秒。在 Temperature （温度） 面板中将温度控制设置为 30 °C。注：此外，我们建议将最大载物台速度（用于在通道之间移动）设置为 0.2 mm/s，以尽量减少 CMG 因阻力而从 DNA 上解离。 在进样口中以 0.5 bar 的恒定压力将所有溶液流入流通池（可在软件的 Pressure Bar 面板中设置）。然后，关闭通道 4 和 5 中的流。在初始流动所有溶液后，将压力降低至 0.2 bar。 将陷印激光器移动到通道 1，直到每个光阱中捕获一个微珠。通过在按下扳机的同时移动操纵杆，将捕获的珠子移动到通道 2。然后，通过使用操纵杆将右侧珠子移向和远离左侧珠子，而不按下扳机，直到 DNA 系绳被捕获（通过在软件的 FD Viewer 面板中监测被捕获的 DNA47 的力-延伸曲线来了解），从而钓出 DNA：CMG 复合物）。对于 DNA 栓系，请确保在“参考模型”面板中输入 DNA 长度和正确的温度值，这将在 FD 查看器面板中自动绘制 DNA 构建体的理论可扩展蠕虫状链模型。如果单个 DNA 分子夹在两个珠子之间，则 DNA 的力延伸行为应与绘制的可伸展蠕虫状链模型紧密匹配。通过监测实验力-拉伸曲线来确保这种情况，软件将自动将其绘制在理论曲线之上。注：与理论模型的偏差可能表明存在多个 DNA 分子结合在磁珠之间和/或存在与 DNA 结合并使其压缩的蛋白质聚集体。为防止蛋白质与 DNA 的力介导解离，在此初始测试期间不要超过 10 pN 的张力。 将微珠移至通道 3 并立即停止所有通道中的流路。在通道 3 中进行单帧测试扫描以确认 CMG 的存在，用 561 nm 激光以 4 μW 的功率照射，在物镜处测得。在 Excitation lasers（激发激光器）面板中调整成像激光功率。如果存在，CMG 将显示为二维衍射极限点，如图 1G 和 图 2A 所示。如果无法捕获 DNA，请检查通道 2 是否有气泡，这会减慢通道 2 中的流动（与通道 1 和 3 相比）。如果存在气泡，请将通道 2 中的压力增加到 1 巴，以尝试将气泡冲洗过来。 如果存在 CMG，将 DNA 系绳移至通道 4 或 5 进行成像;否则，请重新打开流，丢弃磁珠，然后返回步骤 2.2.4。 在通道 4 或 5 中，调整磁珠之间的距离，以在 DNA 系绳中达到 2 pN 的初始张力。为此，请在 Force Spectroscopy（力谱）面板中输入 2 pN，然后单击 Enable （启用） 按钮以启动力钳。一旦初始张力达到 2 pN，在成像前通过单击力谱面板中的启用按钮来禁用力夹。 图像 CMGCdc45-LD555 每 5 秒用 561 nm 激光以 4 μW 的功率在物镜处测量（图 1F）。为此，请单击 开始扫描 图像扫描面板中的按钮。在此类扫描中，CMG 将显示为二维衍射限制点，如图 1G 中的示例所示。如果观察到 CMG，但在漂白前似乎没有移动，请测试用于核酸酶活性的所有蛋白质，因为 DNA 上的缺口会导致 CMG 与 DNA41 解离，严重降低其明显的持续合成能力。注意：如果使用此处使用的商用显微镜，4 μW 的激光功率应提供一致的结果。如果使用自制设置，我们建议根据经验估计最佳激光功率。最佳激光功率应从荧光团提供足够的信号，以所需的精度对其进行定位，并且荧光团的使用寿命接近所需的实验时间范围。注：虽然本出版物侧重于杂交集成和单分子测定，但我们之前已经发表了对该测定生成的数据分析的全面描述48。