Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Verfügung, um anfängliche lokale Ca2+ -Signale, sogenannte Ca2+ -Mikrodomänen, in primären murinen und humanen T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie aufzuklären. Dieses Protokoll dient als wertvolle Ressource für Forscher, die die Ca2+ -Signalwege in Immunzellen untersuchen und ihre Funktion weiter entschlüsseln können.
Lokale, sub-zweite Ca2+ -Signale, die als Ca2+ -Mikrodomänen bezeichnet werden, sind hochdynamische und kurzlebige Ca2+ -Signale, die zu einer globalen [Ca2+]i-Erhöhung führen und möglicherweise bereits das Schicksal einer T-Zelle bestimmen. Bei Aktivierung des T-Zell-Rezeptors wird NAADP schnell gebildet und bindet an NAADP-Bindungsproteine (HN1L/JPT2, LSM12) und ihre jeweiligen Rezeptoren (RyR1, TPC2), die auf intrazellulären Ca2+ -Speichern wie dem ER und den Lysosomen sitzen, und führt zu einer anschließenden Freisetzung und Erhöhung von [Ca2+]i. Um diese schnell und dynamisch ablaufenden Ca2+ -Signale zu erfassen, haben wir eine hochauflösende Bildgebungstechnik entwickelt, die eine Kombination aus zwei Ca2+ -Indikatoren, Fluo-4 AM und FuraRed AM, verwendet. Für die Nachbearbeitung wurde ein quelloffener, halbautomatisierter Ca2+ Microdomain-Detektionsansatz entwickelt, der auf der Programmiersprache Python basiert. Mit diesem Workflow sind wir in der Lage, Ca2+ -Mikrodomänen auf subzellulärer Ebene in primären murinen und humanen T-Zellen in Fluoreszenzvideos mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zuverlässig zu detektieren. Diese Methode kann auch auf andere Zelltypen angewendet werden, wie z.B. NK-Zellen und murine neuronale Zelllinien.
Die vorgestellte Fluoreszenzmikroskopietechnik ermöglicht die Visualisierung lokaler, temporaler initialer Calciumsignale (Ca2+) in primären T-Zellen der Maus, den sogenannten Ca2+ -Mikrodomänen. Ca2+ -Mikrodomänen stellen hochdynamische und kurzlebige Ca2+ -Signalereignisse dar, die eine Herausforderung für eine effektive Bildgebung und Analyse lebender Zellen darstellen1.
T-Zellen stellen aufgrund der relativen Unterschiede in der zentralen und peripheren Fluoreszenzintensität, die auf ihre kugelförmige Form und ihren geringen Durchmesser von ~6-8 μm zurückzuführen sind, eine Herausforderung für die Bildgebung von lebenden Zellen dar. Nach der Stimulation und der Bildung von Immunsynapsen erfahren T-Zellen morphologische Veränderungen, was die Bildgebung von T-Zellen weiter erschwert1. Daher ist die Anwendung einer ratiometrischen Analyse unerlässlich, die entweder durch die Aufnahme von zwei Bildern, die unterschiedliche Eigenschaften eines Ca2+ -Farbstoffs darstellen, oder durch die Verwendung einer Kombination aus zwei Ca2+ -Farbstoffen erreicht wird. Zu den anspruchsvollen Eigenschaften von Ca2+ -Mikrodomänen gehört ihre schnelle, zeitliche und räumlich begrenzte Natur. Um dies zu erfassen, müssen die verwendeten Ca2+ -Farbstoffe sowohl eine hohe basale Helligkeit als auch ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) aufweisen, um eine möglichst hohe zeitliche und räumliche Auflösung zu erhalten. Optimale Ergebnisse wurden mit einer Kombination aus dem Dual-Wellenlängen-Farbstoff Fura Red und dem Single-Wellenlängen-Farbstoff Fluo-4 erzielt. Co-Loading-Zellen mit Fluo-4 und Fura Red mildern die Herausforderungen, die sich aus dem starken Photobleaching von Dual-Emissions-Wellenlängenfarbstoffen und der zeitlichen Verzögerung von Dual-Excitation-Farbstoffen ergeben, und gewährleisten so die Eignung für eine schnelle Bildaufnahme. Dieser Ansatz erleichtert außerdem die Visualisierung von Formveränderungen und subtilen Bewegungen. Besondere Anforderungen werden auch an das abbildende System in Bezug auf die räumliche Auflösung gestellt, um die Visualisierung von Ca2+ -Signalen zu ermöglichen, die aus der Öffnung kleiner Kanalcluster oder sogar einzelner Kanäle1 stammen.
Der Ca2+-Signalweg spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung von Immunfunktionen in T-Zellen, einschließlich der Synapsenbildung und der Zytokinproduktion und -freisetzung 2,3. Das spezifische Schicksal der Zelle wird durch die unterschiedlich ausgeprägten und lokal verteilten Ca2+-Signale, dieCa2+-Mikrodomänen3, reguliert. Bemerkenswert ist, dass diese lokalen Ca2+-Signale einem weit verbreiteten Anstieg der intrazellulären Ca2+-Spiegel in T-Zellen vorausgehen und die Bildung von Ca2+-Mikrodomänen sowohl vom Eintritt als auchvon der Freisetzung von Ca2+–1,4,5 abhängt. Bei Stimulation des T-Zell-Rezeptors (TCR)/CD3 wird die Bildung von Ca2+-freisetzenden Botenstoffen wie Nikotinsäure, Adenindinukleotidphosphat (NAADP), D-Myo-Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und zyklischer ADP-Ribose (cADPR) ausgelöst, was zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Spiegel auf bis zu 1 μM 6,7 führt. Frühe Ca2+-Signalereignisse sind mit der Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Ca2+-Speichern wie dem endoplasmatischen Retikulum (ER) verbunden, wobei Kanäle wie der Ryanodinrezeptor 1 (RyR1) und derIP3-Rezeptor (IP3R) überwiegend für diese Signalübertragung verantwortlich sind. Dies löst anschließend einen extrazellulären Ca2+-Einstrom aus und führt zu einem globalen Ca2+-Signal über den speicherbetriebenen Ca2+-Eintrag (SOCE)8. Darüber hinaus gibt es andere Kanäle, die an der Ca2+-Signalgebung während der T-Zell-Aktivierung beteiligt sind9, z. B. P2X4- und P2X7-Kanäle sorgen für einen Adenosintriphosphat (ATP)-abhängigen Kationeneinstrom, der zum Anstieg des intrazellulären Ca2+-Gehalts beiträgt. Bemerkenswert ist, dass anfängliche adhäsionsabhängige Ca2+-Mikrodomänen (ADCMs) bereits vor der TCR-Stimulation gebildet werden, jedoch mit niedrigeren Ca2+-Amplituden und -Frequenzen. Diese initialen TCR-unabhängigen Ca2+-Signale dienen höchstwahrscheinlich der Migration der T-Zellen zum Entzündungsort und bereiten die T-Zellen auf die Restimulation am Infektionsort vor10,11.
Durch die Entwicklung der beschriebenen Methode zur lokalen Ca2+ -Bildgebung haben wir ein zusätzliches Werkzeug zur Erforschung des Ursprungs und der Bedeutung früher Ca2+ -Signale bei der T-Zell-Aktivierung gewonnen. Diese Methode ermöglicht es dem Anwender, kleinere, kurzlebige und schneller auftretende Ca2+ -Signale zu erkennen, als dies bisher möglich war. Darüber hinaus ermöglicht Deconvolution, Analysis, Registration, Tracking, and Shape normalization (DARTS), die Python-basierte Analysepipeline, die gemeinsame Nutzung der Analysewerkzeuge mit einem breiteren Publikum12.
Wir haben ein umfangreiches Protokoll für die hochauflösende Lebendzellbildgebung von lokalen Ca2+-Mikrodomänen in primären murinen und humanen T-Zellen beschrieben, die durch TCR/CD3-Stimulation durch Antikörper-beschichtete Kügelchen ausgelöst werden. Darüber hinaus haben wir einen benutzerfreundlichen und quelloffenen Python-basierten Algorithmus implementiert, um lokale Ca2+-Signale zu identifizieren und zu analysieren. Bemerkenswert ist, dass das Protokoll nicht auf die Detektion von Ca2+-Mikrodomänen im Rahmen der TCR/CD3-Stimulation beschränkt ist, sondern auch auf andere (Immun-)Zelltypen wie NK-Zelllinien (KHYG-1)12 oder TCR-unabhängige Ca2+-Mikrodomänen10,11 adaptierbar ist.
Ein kritischer Schritt innerhalb des Protokolls ist die Größe und Anzahl der stimulierenden Kügelchen. Um eine Immunsynapse nachzuahmen, sollten die Kügelchen ähnlich groß wie die Zellen sein. Daher verwenden wir für primäre murine und humane T-Zellen sowie Zelllinien (Jurkat und KHYG1) magnetische Kügelchen mit einem Durchmesser von 10 μm. Darüber hinaus sollte jede Zelle nur durch eine einzige Kugel stimuliert werden. Daher sollte einerseits die Anzahl der Perlen, die zu jedem Objektträger hinzugefügt werden, ausreichend sein, aber wenn sich zu viele Perlen im Sichtfeld befinden, nimmt der Hintergrund zu, und es ist nicht möglich, einen einzigen Aktivierungszeitpunkt und eine Kontaktseite zu erkennen.
Das Protokoll verwendet die fluoreszierenden Ca2+ -Farbstoffe Fluo-4 AM und FuraRed AM auf ratiometrische Weise, was eine Kalibrierung der Daten13 ermöglicht. Darüber hinaus könnte das Protokoll an andere Ca2+ -Indikatorpaare angepasst werden, aber bei der Auswahl ist Vorsicht geboten, was die Ca2+ -Bindungskinetik, die subzelluläre Verteilung und das Photobleaching1 betrifft. Darüber hinaus müssen die Beladungsbedingungen für jeden einzelnen Zelltyp entwickelt und optimiert werden, aber die hier angegebenen Konzentrationen sind ein guter Ausgangspunkt. Um Ca2+ -Mikrodomänen sichtbar zu machen, sollte die Kd der Ca2+ -Farbstoffe im Bereich von 300-1200 nM liegen und die Erfassungszeit pro Frame sollte ≤60 ms betragen. Ist die Fluoreszenzintensität zu gering, muss das Filterset überprüft werden, es ist aber auch möglich, eine doppelte Menge Ca2+ Farbstoff in T-Zellen zu laden. Der Ca2+ -Farbstoff könnte sich jedoch zu anderen Organellen verlagern oder an Vesikel sequestrieren, aber er könnte auch alsCa2+ -Puffer fungieren und dieCa2+ -Reaktionen beeinflussen.
Eine Einschränkung des Analysealgorithmus besteht darin, dass eine kugelförmige Form der Zelle angenommen wird; Daher kann es sein, dass Zelltypen mit unterschiedlichen Morphologien eine Anpassung der Analyse-Toolbox erfordern. Der Algorithmus wurde zur Analyse lokaler Ca2+-Mikrodomänen in primären murinen T-Zellen sowie von Jurkat-T-Zellen und einer NK-Zelllinie (KHYG-1)12 verwendet und war erfolgreich bei der Analyse von Ca2+-Mikrodomänen für eine murine neuronale Zelllinie (N2a, unveröffentlichte Daten). Prinzipiell könnte der Protokoll- und Analysebaukasten verwendet werden, um nicht-sphärische Zelltypen wie HEK293- oder HeLa-Zellen zu analysieren, aber für diese Zelltypen kann die Darterscheibenprojektion nicht angepasst werden, da sie auf einer runden Struktur- und Formnormalisierung der Zellen basiert. Darüber hinaus kann das Protokoll zum Nachweis lokalisierter anfänglicher Ca2+-Mikrodomänen nach Bead-Stimulation angepasst werden, um lokale Ca2+-Signale zu analysieren, die von anderen Stimuli abgeleitet werden, wie z. B. löslichen aktivierenden oder hemmenden Verbindungen sowie adhäsionsabhängigen und TCR/CD3-unabhängigen Ca2+-Mikrodomänen10,11. Bemerkenswert ist, dass es einfacher ist, einen einzelnen Kügelchenkontakt in Bezug auf Zeit und Ort zu definieren, als den Startpunkt der Aktivierung nach löslichen Verbindungen zu bestimmen.
Eine generelle Einschränkung für die Detektion derCa2+ -Mikrodomänenbildung liegt in der geforderten hohen zeitlich-räumlichen Auflösung und dem notwendigen hohen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Derzeit erreicht die aus unserem Aufbau abgeleitete Auflösung eine berechnete räumliche Auflösung von ~0,368 μm und eine zeitliche Auflösung von ~40 Bildern pro Sekunde (fps)1. Jüngste Fortschritte in der Kamera- und Detektorentwicklung sowie die Verbesserung von Fluoreszenzfarbstoffen könnten dazu führen, dass optische Einkanal-Aufzeichnungen, wie sie für ORAI-GECI (genetisch exprimierte Ca2+ –Indikatoren) beschrieben wurden, in Zukunft für die Lebendzellbildgebung unter Verwendung von Ca2+- Indikatoren mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung erreicht werden können.
Zusammengenommen kann das hier beschriebene Protokoll und Analysewerkzeug für hochauflösende Ca2+ -Mikrodomänen-Bildgebung nicht nur zur Analyse anfänglicher lokaler Ca2+ -Signale in T-Zellen verwendet werden, sondern auch auf andere Zelltypen angepasst werden, um die Bedeutung der lokalen Ca2+ -Signalübertragung in diesen zu entschlüsseln.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Projektnummer 335447717; SFB1328, A02 bis B-PD und RW; A14 nach ET; Projektnummer 516286863 zu B-PD). Die Autoren danken den Blutspendern und der Klinik für Transfusionsmedizin am UKE für die Zusammenarbeit.
α-CD3 | BD Pharmingen | 553058 | |
α-CD28 | BD Pharmingen | 553295 | |
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Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco, Thermo Fisher | 14190144 | |
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Silicon grease (basylone) | Bayer | 291-1220 | |
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