Summary

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Published: August 02, 2024
doi:

Summary

Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll für den Nachweis von Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen vor.

Abstract

Die DNA-Schadensantwort ist ein genetischer Informationsschutz, der Zellen davor schützt, beschädigte DNA aufrechtzuerhalten. Die Charakterisierung der Proteine, die in diesem Prozess zusammenarbeiten, ermöglicht die Identifizierung alternativer Ziele für therapeutische Eingriffe bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs, altersbedingten Krankheiten und chronischen Entzündungen. Der Proximity Ligand Assay (PLA) hat sich als Werkzeug zur Abschätzung der Wechselwirkung zwischen Proteinen sowie der räumlichen Nähe zwischen Organellen oder zellulären Strukturen herauskristallisiert und ermöglicht die zeitliche Lokalisierung und Co-Lokalisationsanalyse unter Stressbedingungen. Die Methode ist einfach, da sie der herkömmlichen Immunfluoreszenz ähnelt und die gleichzeitige Färbung eines Organellen, einer zellulären Struktur oder eines spezifischen Markers wie Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum, PML-Körper oder DNA-Doppelstrangmarker, yH2AX, ermöglicht. Die Phosphorylierung des S139 an der Histon-2A-Variante, H2AX, damals als yH2AX bezeichnet, wird häufig als sehr empfindlicher und spezifischer Marker für DNA-Doppelstrangbrüche verwendet. Jeder Fokus der yH2AX-Färbung entspricht einem Bruch in der DNA, der einige Minuten nach der Schädigung auftritt. Die Analyse von Veränderungen in yH2AX-Foki ist der gebräuchlichste Assay, um zu untersuchen, ob das Protein von Interesse an der DNA-Schadensantwort (DDR) beteiligt ist. Unabhängig davon, ob eine direkte Rolle an der DNA-Schadensstelle erwartet wird, wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Kolokalisation des interessierenden Proteins mit yH2AX-Herden zu verifizieren. Abgesehen von den neuen superauflösenden Fluoreszenzmethoden kann die lokale Interaktion mit DNA-Schadensstellen jedoch ein wenig subjektiv sein. Hier zeigen wir einen Assay zur Bewertung der Lokalisierung von Proteinen im DDR-Signalweg unter Verwendung von yH2AX als Marker für die Schädigungsstelle. Dieser Assay kann verwendet werden, um die zeitliche Lokalisation unter verschiedenen Beleidigungen zu charakterisieren, die DNA-Schäden verursachen.

Introduction

Zelluläre DNA-Schäden treten täglich aufgrund der spontanen chemischen Reaktionen auf und werden auch durch exogene Faktoren wie genotoxische Wirkstoffe (Strahlung und Chemikalien wie Etoposid) und oxidativen Stress verstärkt 1,2,3. Die Zellen verfügen über eine komplexe Maschinerie, die eine Vielzahl verschiedener Arten von DNA-Schäden korrigiert, von der Entfernung von Basen über die replikative Gabeltorsion bis hin zur Unterbrechung der schädlichsten Läsion: dem DNA-Doppelstrangbruch 4,5.

Mehrere Proteine, die an der DDR beteiligt sind, wurden bereits charakterisiert, und ausgezeichnete Revisionen untersuchen die Wege der nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) und der homologen Rekombination (HR), die Hauptwege, die bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) impliziert sind 5,6. Die Phosphorylierung der Histon-H2A-Variante H2AX an Serin 139 (im Folgenden als y-H2AX bezeichnet) wird seit vielen Jahren als sensitiver und zuverlässiger Marker für den Doppelstrangbruch verwendet. Die Phosphorylierung von H2AX wird in den ersten Minuten nach der Schädigung beobachtet und kann über Stunden anhalten7.

Der Vorteil der Immunfluoreszenzdetektion von γ-H2AX-Foki liegt in der Charakterisierung der zeitlichen und räumlichen Verteilung der Foci, sowie deren Co-Färbung mit anderen Proteinen. Darüber hinaus ist bei der Immunfluoreszenz keine Lyse erforderlich, wodurch die zellulären Kontextinformationen erhalten bleiben und sie informativer werden. Da γ-H2AX de novo gebildet wird, ist es außerdem nicht reichlich vorhanden, wenn keine DNA-Schäden vorliegen, was es zu einem spezifischen Marker macht7.

H2AX wird hauptsächlich durch die Proteinkinase Ataxie-Teleangiektasie mutierte (ATM) und DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK) phosphoryliert, die Sensoren der DSBs. Ku70/80 (XRCC6 Röntgenreparatur kreuzkomplementär 6/ XRCC5 Röntgenreparatur kreuzkomplementär 5) und DNA-Proteinkinase katalytische Untereinheit (DNA-PKcs) sind für die DSB-Identifizierung und den Schutz der DNA-Enden verantwortlich, während Artemis die Endverarbeitung durchführt, um die Ligation durch den XRCC4-Ligase IV-Komplex zu erleichtern. Die Phosphorylierung von H2AX an Stellen, die DSBs flankieren, fungiert als Signal für die Rekrutierung mehrerer Reparaturproteine und als Signalsignal für den Zellzyklusarrest, den Tod oder das Überleben8.

Die Analyse von Veränderungen in y-H2AX-Foki ist der gebräuchlichste Assay, um zu untersuchen, ob das interessierende Protein an der DNA-Schadensantwort beteiligt ist. Unabhängig davon, ob eine direkte Rolle an der DNA-Schädigungsstelle erwartet wird, wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Kolokalisation des interessierenden Proteins mit y-H2AX-Herden zu verifizieren. Abgesehen von den neuen superauflösenden Fluoreszenzmethoden kann es jedoch schwierig sein, auf die lokale Wechselwirkung mit DNA-Schadensstellen zu schließen. Darüber hinaus hängt der Immunfluoreszenznachweis in der Regel von vielen Proteinmolekülen an der DNA-Schadensstelle ab, was die Identifizierung knapper Proteine erschwert9.

Hier zeigen wir einen Assay zur Bewertung der Lokalisierung von Proteinen, die am DDR-Signalweg beteiligt sind, unter Verwendung von y-H2AX als Marker für die Schadensstelle. Dieser Assay kann verwendet werden, um die zeitliche Lokalisation unter verschiedenen Beleidigungen zu charakterisieren, die DNA-Schäden verursachen.

Der Proximity Ligand Assay (PLA) hat sich als Werkzeug zur Abschätzung der Wechselwirkung zwischen Proteinen sowie der räumlichen Nähe zwischen Organellen oder zellulären Strukturen erwiesen10,11 und ermöglicht die zeitliche Lokalisierung und Co-Lokalisationsanalyse unter Stressbedingungen. Die Methode ist einfach, da sie wie die herkömmliche Immunfluoreszenz ist und die gleichzeitige Färbung von organellen- oder zellstrukturspezifischen Markern wie Mitochondrien, endoplasmatischem Retikulum, PML-Körpern oder dem DNA-Doppelstrangmarker yH2AX ermöglicht. Die Verwendung von PLA ermöglicht die Identifizierung der Proteininteraktion während der DNA-Schädigung auf empfindliche, spezifische und zuverlässige Weise, die zur Überwachung der Interaktion während des Zellzyklus, als Reaktion auf verschiedene Reize und zu verschiedenen Zeiten nach genotoxischem Stress verwendet werden kann.

Wir zeigen hier die Verwendung von PLA parallel zur konventionellen γ-H2AX-Immunfluoreszenz zur Lokalisierung der Nek4-Ku70-Interaktion nach Etoposid-induzierter DNA-Schädigung. Nek4, ein Familienmitglied der Nek (NIMA-verwandte Kinasen), spielt keine klare Rolle bei der Reaktion auf DNA-Schäden. Im Jahr 2012 zeigten Nguyen und Kollegen, dass Nek4 mit Ku70/Ku80-Proteinen interagiert, und in Abwesenheit von Nek4 werden diese Proteine nicht an die DNA-Schadensstelle rekrutiert, und die H2AX-Phosphorylierung ist beeinträchtigt12. Die zelluläre Lokalisation dieser Interaktion ist bisher nicht bekannt. Wir haben eine Verringerung der Ku70-Phosphorylierung in Zellen beobachtet, die die Nek4-Kinase-tote Mutante13exprimieren, aber ob Nek4 direkt Ku70 phosphoryliert, muss noch geklärt werden. In Anbetracht der Tatsache, dass die Interaktion von Nek4 mit Ku70 nach einer Etoposidbehandlung gemäß Immunpräzipitationsstudien12 erhöht ist, versuchen wir, diese Interaktion mit PLA und dem γ-H2AX-Marker zu lokalisieren.

In der Regel basieren die Interaktionsstudien auf Immunpräzipitationsassays, diese sind jedoch in vitro und geben keine Auskunft über den Ort der Interaktion. Wenn möglich, kann eine Immunpräzipitation von fraktionierten Zellen (Zellkern, Mitochondrien, Zellmembran oder Zytosol) durchgeführt werden, aber die Durchführung eines zeitlichen Verlaufs der Interaktion ist kostspielig und mühsam. Immunfluoreszenz kann Aufschluss über die zelluläre Lokalisation der Proteine geben, aber der Nachweis der Wechselwirkung kann schwierig sein und hängt von der Auflösung der Mikroskope ab. Hier zeigen wir den Vorteil der Verwendung des Proximity-Liganden-Assays, um die Interaktion zweier Proteine im Zusammenhang mit DNA-Schäden zu überwachen.

Protocol

1. Beschichtung der Zelle HINWEIS: Zellen können in mikroskopisch kleinen Fluoreszenz-Objektträgern, -Kammern oder -Platten ausgesät werden. Die Verwendung von kleinen Deckgläsern oder 96/384-Well-Platten wird empfohlen, um mehrere Bedingungen und Ersatzreagenzien zu testen. Die Verwendung von Deckgläsern ist bei Zelllinien ratsam, die sich leicht ablösen, wie z.B. HEK293-Zellen. Die Deckgläser können zuvor mit einer Poly-L-Lysin-Lösung…

Representative Results

Wir haben eine Nek4-Ku70-Wechselwirkung in Abwesenheit einer Etoposidbehandlung beobachtet. Diese Wechselwirkung kann jedoch auch außerhalb des Zellkerns stattfinden (Abbildung 1A). Die Nek4-Ku70-Wechselwirkung nimmt nach DNA-Schäden zu und konzentriert sich im Zellkern (Abbildung 1A). Im Fall der Nek5-Topoisomerase II β (TOPIIβ)-Interaktion, die in diesem Assay als Positivkontrolle auf der Grundlage von Literaturergebnissen…

Discussion

Die Daten zeigen, dass die gleichzeitige Verwendung von PLA mit einem DNA-geschädigten Marker die meisten Informationen in einem DNA-Schadensantwort-Profiling liefern kann, das das räumliche und zeitliche Verhalten der Interaktion nach der Beleidigung zeigt. PLA ist eine vielseitige Methode, die zur Identifizierung der Dimerisierung, zur Bestimmung des Kontakts von Organellen, zur Protein-Nukleinsäure-Interaktion und hauptsächlich zur Protein-Protein-Interaktion verwendet wurde 10,11…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, über Grant Temático 2022/15126-9 an JK und Stipendium 21/09439-1 an LARM) und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) für die Finanzierung dieser Forschung.

Materials

Black 384-well plates Perkin Elmer Cell carrier plates
Donkey  anti- Rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 1:300
Duo link Donkey anti Mouse Minus Sigma DUO92004
Duolink antibody diluent Sigma DUO82008
Duolink blocking solution 1X Sigma DUO82007
Duolink Detection reagent Far red Sigma DUO92013
Duolink Donkey anti goat plus Sigma DUO92003
Duolink Donkey anti rabbit plus Sigma DUO92002
Etoposide Sigma E1383
Goat anti Nek4 Santa Cruz Biotechnology SC-5517 goat anti Nek4 was used at 1:50 dilution
Hoechst 33342 Thermo H1399 0.6 µg/mL
Leica DMI microscope Leica
Mouse anti Ku70 Thermo MA5-13110 mouse anti Ku70 was used at 1:100 dilution
Mouse anti TOPIIβ Santa Cruz Biotechnology SC-365071 1:25
Rabbit anti Nek5 Santa Cruz Biotechnology SC-84527 1:25
Rabbit anti Y H2AX Cell Signalling 9718S 1:100 dilution
U2OS cell line ATCC HTB-96 

Referenzen

  1. Xiao, W., Samson, L. In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).
  2. Lindahl, T., Barnes, D. E. Repair of endogenous DNA damage. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).
  3. Hoeijmakers Jan, H. J. DNA damage, aging, and cancer. N Engl J Med. 361 (15), 1475-1485 (2009).
  4. Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745 (2011).
  5. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: Making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  6. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  7. Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
  8. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).
  9. Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks. Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).
  10. Karchugina, S., Chernoff, J. Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay. J Vis Exp. (140), (2018).
  11. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. J Vis Exp. (118), (2016).
  12. Nguyen, C. L., et al. Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts. Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).
  13. Basei, F. L., et al. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Sci. 13 (1), 11 (2015).
  14. . . Animal Cell Culture Guide. , (2024).
  15. Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure. MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).
  16. Wei, F., et al. Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response. Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide. J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).
  19. George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines. STAR Protoc. 3 (2), 101340 (2022).
  20. Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells. RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).
  21. Hegazy, M., et al. Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ. Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115 (2020).
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

Diesen Artikel zitieren
Basei, F. L., Moura, L. A. d. R., Ferreira, V. d. C., Nascimento, A. F. Z., Kobarg, J. Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites. J. Vis. Exp. (210), e67072, doi:10.3791/67072 (2024).

View Video