In dieser Arbeit beschreiben wir ein in vitro Modell zur Isolierung und Differenzierung von murinen Atemwegsepithelzellen, wobei der Schwerpunkt auf ihrer Akklimatisierung an chronischen Zigarettenrauchextrakt (CSE) liegt. Das Modell könnte verwendet werden, um die Multi-Omics-Auswirkungen von CSE umfassend zu charakterisieren, was möglicherweise Einblicke in die zellulären Reaktionen unter chronischer Rauchbelastung liefert.
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) wird weitgehend auf die Exposition gegenüber Tabakrauch zurückgeführt. Die Untersuchung, wie sich Epithelzellen der Atemwege funktionell an Tabakrauch anpassen, ist entscheidend für das Verständnis der Pathogenese von COPD. In der vorliegenden Studie wurde ein in vitro-Modell mit primären Epithelzellen der Maus erstellt, um die Auswirkungen von Tabakrauch in der Praxis nachzuahmen. Im Gegensatz zu etablierten Zelllinien behalten Primärzellen eher in vivo-ähnliche Eigenschaften bei, einschließlich Wachstumsmuster, Alterung und Differenzierung. Diese Zellen weisen eine empfindliche Entzündungsreaktion und eine effiziente Differenzierung auf und bilden somit die physiologischen Bedingungen genau ab. In diesem Modell wurden primäre murine Atemwegsepithelzellen 28 Tage lang unter einer Luft-Flüssig-Grenzfläche mit einer optimalen Konzentration an Zigarettenrauchextrakt (CSE) kultiviert, was zur Umwandlung einer Monoschicht undifferenzierter Zellen in ein pseudostratifiziertes Säulenepithel führte, was auf eine CSE-Akklimatisierung hinweist. Umfassende Multi-Omics-Analysen wurden dann angewendet, um die Mechanismen aufzuklären, durch die CSE die Differenzierung der basalen Atemwegszellen beeinflusst. Diese Erkenntnisse ermöglichen ein tieferes Verständnis der zellulären Prozesse, die dem Fortschreiten der COPD als Reaktion auf Tabakrauch zugrunde liegen.
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine heterogene Lungenerkrankung mit komplexen Merkmalen, wobei Patienten mit COPD nach und nach jünger werden1. Rauchen, ein primärer Risikofaktor für COPD2, hat einen tiefgreifenden Einfluss auf die Epithelzellen der Atemwege, die als Ausgangsbarriere gegen Tabakrauch dienen. Trotz dieses bekannten Zusammenhangs sind die detaillierten Mechanismen, durch die Tabakrauch Veränderungen in den Epithelzellen der Atemwege hervorruft, nach wie vor unzureichend erforscht. Ein gründliches Verständnis dieser molekularen Veränderungen ist unerlässlich, um frühe diagnostische Marker und therapeutische Ziele für COPD zu identifizieren.
Um diese Lücke zu schließen, haben wir ein neuartiges in vitro-Modell mit murinen Atemwegsepithelzellen entwickelt. Diese Zellen wurden einer Langzeitstimulation mit Zigarettenrauchextrakt (CSE) unterzogen, was es uns ermöglichte, dynamische zelluläre Veränderungen zu beobachten und die Veränderungen in den Epithelzellen der Atemwege unter langfristiger Tabakstimulation und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen. In diesem Modell wurde Transwell verwendet, um die Luft-Flüssig-Grenzfläche von Epithelzellen der Atemwege bereitzustellen, und Zigarettenrauchextrakt wurde im frühen Stadium der Epithelzelldifferenzierung bis zum Ende der Differenzierung nach 28 Tagen stimuliert. Frühere Studien untersuchten nur die Differenzierung und kurzfristige Stimulation von Epithelzellen der Atemwege (Zellliniendominanz). Sie waren auf einen einzigen Regulationsweg beschränkt 3,4,5,6. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet jedoch primäre Atemwegsepithelzellen der Maus und optimiert den Zellextraktionsprozess für eine bessere Zellaktivität als frühere Epithelzellkulturmethoden der Atemwege. Dieses Modell konzentriert sich auf Veränderungen in der zellulären Differenzierung neben umfassenden transkriptomischen, proteomischen, metabolomischen und epigenomischen Analysen. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz und fortschrittlichen Multi-Omics-Techniken wollten wir die zellulären Reaktionen von Atemwegsepithelzellen auf chronische Tabakrauchexposition aufklären und so zu einem tieferen Verständnis der COPD-Pathogenese beitragen. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Veränderungen im Differenzierungsmuster der Epithelzellen der Atemwege und deren Mechanismus zu untersuchen, die durch die langfristige Stimulation verschiedener Schadstoffe verursacht werden.
COPD ist eine häufige chronische Entzündungserkrankung der Atemwege. Die Exposition gegenüber Tabakrauch führt zu chronischen Entzündungen der Atemwege, einem Umbau der Atemwege und einer strukturellen Zerstörung der Lunge, die das Ergebnis des Zusammenspiels verschiedener Strukturzellen und Immunzellen ist10. Als Frontlinie des angeborenen Immunsystems in der Lunge spielen Epithelzellen der Atemwege eine sehr wichtige Rolle bei der Entwicklung der Krankheit11. Vor di…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (82090013) unterstützt.
100x Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 15140122 | |
24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert, Sterile | BIOFIL | TCS016012 | |
40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
500x Gentamicin/Amphotericin Solution | Gibco | R01510 | |
acetylated α-Tubulin | CST | #5335 | |
Acetyl-α-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb | cellsignal | #5335 | |
Animal Component Free Cell Dissociation Kit | Stemcell | 05426 | |
Anti-pan Cytokeratin antibody | abcam | ab7753 | |
Cigarette | Marlboro | ||
Claudin3 | immunoway | YT0949 | |
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
Deoxyribonuclase I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | |
Ham’s F-12 | Sigma-Aldrich | N6658 | |
Heparin Solution | Stemcell | 07980 | |
Hydrocortisone Stock Solution | Stemcell | 07925 | |
Mucin 5AC | abcam | ab212636 | |
Occludin | proteintech | 27260-1-AP | |
PBS | Cytosci | CBS004S-BR500 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140122 | |
PneumaCult-ALI Basal Medium |
Stemcell | 05002 | |
PneumaCult-ALI 10x Supplement | Stemcell | 05003 | |
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | Stemcell | 05006 | |
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement | Stemcell | 05042 | |
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium | Stemcell | 05041 | |
Pronase E | Sigma-Aldrich | P5147 | |
Rat tail collagen | Corning | 354236 | |
Trypan Blue | Stemcell | 07050 |