Summary

Langzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs in hochdifferenzierten und polarisierten retinalen Pigmentepithelkulturen

Published: August 16, 2024
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Summary

Wir stellen ein neuartiges Gerät zur Messung des Sauerstoffverbrauchs (OCR) in retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) vor. Das Gerät kann die OCR wochenlang an RPE messen, das auf Standard-Zellkulturplatten mit Standardmedien gezüchtet wurde, während sich die Platten in einem Standard-Zellkulturinkubator befinden.

Abstract

Der mitochondriale Stoffwechsel ist entscheidend für die normale Funktion des retinalen Pigmentepithels (RPE), einer Monoschicht von Zellen in der Netzhaut, die für das Überleben der Photorezeptoren wichtig ist. Die mitochondriale Dysfunktion von RPE ist ein Kennzeichen der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, und der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR), einer erblindenden Komplikation von Netzhautablösungen. RPE-degenerative Erkrankungen wurden durch RPE-Kultursysteme, die hochdifferenziert und polarisiert sind, um in vivo RPE nachzuahmen, gut modelliert. Die Überwachung der Sauerstoffverbrauchsraten (OCR), eines Indikators für die mitochondriale Funktion, erwies sich in solchen Kultursystemen jedoch als schwierig, da die Bedingungen, die eine ideale RPE-Polarisation und -Differenzierung begünstigen, keine einfachen OCR-Messungen ermöglichen.

Hier stellen wir ein neuartiges System, Resipher, vor, um OCR wochenlang in gut differenzierten RPE-Kulturen zu überwachen, während das RPE auf optimalen Wachstumssubstraten und physiologischen Kulturmedien in einem Standard-Zellkultur-Inkubator gehalten wird. Dieses System berechnet die OCR, indem es den Sauerstoffkonzentrationsgradienten misst, der in den Medien über den Zellen vorhanden ist. Wir diskutieren die Vorteile dieses Systems gegenüber anderen Methoden zur Erkennung von OCR und wie man das System zur Messung von OCR in RPE-Kulturen einrichtet. Wir behandeln wichtige Tipps und Tricks für die Verwendung des Systems, Vorsicht bei der Interpretation der Daten und Richtlinien für die Fehlerbehebung bei unerwarteten Ergebnissen.

Wir bieten auch einen Online-Rechner zur Extrapolation des Hypoxie-, Normoxie- oder Hyperoxie-RPE-Niveaus an, die auf dem Sauerstoffgradienten in den Medien über den vom System erkannten Zellen basieren. Schließlich untersuchen wir zwei Anwendungen des Systems, die Messung des Stoffwechselzustands von RPE-Zellen in einem PVR-Modell und das Verständnis, wie sich das RPE metabolisch an Hypoxie anpasst. Wir gehen davon aus, dass die Verwendung dieses Systems an hochpolarisierten und differenzierten RPE-Kulturen unser Verständnis des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitszuständen verbessern wird.

Introduction

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus funktionell postmitotischen, hochpolarisierten Epithelzellen, die eine Barriere zwischen lichtempfindlichen Photorezeptoren in der Netzhaut und deren Durchblutung bilden, ein Kapillarbett, das als Choriokapillaris bezeichnet wird. Wie die Rolle der Glia-unterstützenden Neuronen erfüllt das RPE unzählige Funktionen zur Unterstützung von Photorezeptoren, einschließlich der Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren, des Transports von Nährstoffen und der metabolischen Unterstützung der Photorezeptoren sowie der Sekretion essentieller Wachstumsfaktoren, die alle für die Aufrechterhaltung der Sehfunktion entscheidend sind.

Die Degeneration des RPE liegt mehreren häufigen degenerativen Erkrankungen des Sehvermögens zugrunde. Bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer der häufigsten Ursachen für unheilbaren Sehverlust weltweit, stirbt das RPE ab, und die darüber liegenden Photorezeptoren erleiden daher eine sekundäre Degeneration. Bei der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR) verlässt das RPE stattdessen seinen normalerweise ruhenden postmitotischen Zustand, proliferiert sich und dedifferenziert sich in einen mesenchymalen Zustand (einen sogenannten epithelial-mesenchymalen Übergang [EMT]) mit Veränderungen in seinem Stoffwechsel. Die RPE-Dedifferenzierung führt zu einem Verlust der RPE-Unterstützung für Photorezeptoren und löst gleichzeitig einen fibrotischeren Zustand aus. Dies führt sowohl zu einer Degeneration der Photorezeptoren als auch zu einer RPE-induzierten Narbenbildung, die beide einen Sehverlust auslösen 1,2.

Ein großer Teil der Unterstützung der Photorezeptoren durch RPE ist metabolisch, und metabolische Dysregulation ist ein kritischer Faktor bei zahlreichen Netzhauterkrankungen, einschließlich AMD und PVR. Das RPE dient als regulatorische Barriere zwischen den Photorezeptoren und ihrer Sauerstoff- und Nährstoffquelle, der Choriokapillaris. Daher bestimmt das, was das RPE metabolisiert, im Vergleich zu dem, was das RPE von der Choriokapillaris zu den Photorezeptoren durchdringt, stark den Photorezeptorstoffwechsel und das Überleben. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das RPE für seine normale Gesundheit stark vom mitochondrialen Stoffwechsel abhängig ist und dass die Photorezeptoren stattdessen stark auf die Glykolyse angewiesensind 3. Dadurch wurde das Konzept komplementärer, miteinander verflochtener Stoffwechselzustände zwischen Photorezeptoren und dem RPE eingeführt. Insbesondere reduziert das RPE seinen Metabolismus von bevorzugten Photorezeptor-Stoffwechselsubstraten und nutzt stattdessen die Nebenprodukte des Photorezeptorstoffwechsels in Kombination mit den Metaboliten, die Photorezeptoren nicht verbrauchen. Bei Krankheiten wie PVR und AMD deuten Hinweise stark darauf hin, dass das RPE glykolytischer und weniger abhängig vom mitochondrialen Stoffwechsel wird; Diese Verschiebung hin zur RPE-Glykolyse kann dazu führen, dass die Photorezeptoren die benötigten Metaboliten verlieren, was zu einer Degeneration führt 4,5,6. Angesichts der gegenseitigen Abhängigkeit von RPE und Photorezeptorstoffwechsel und der Tatsache, wie stark ein veränderter Stoffwechsel der Netzhauterkrankung zugrunde liegt, besteht ein starkes Interesse an der Modellierung und Manipulation des RPE-Stoffwechsels für therapeutische Zwecke.

Während die Untersuchung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels in vivo ideal ist, können viele Aspekte des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels nur in einem in vitro-Kultursystem praktisch untersucht werden. In den letzten Jahrzehnten wurden erhebliche Fortschritte auf dem Weg zu High-Fidelity-RPE-Kulturen erzielt, so dass die am sorgfältigsten gepflegten RPE-Kulturen heute in klinischen Studien am Menschen für die Zellersatztherapie verwendet werden7. Um solche High-Fidelity-Kulturen zu erhalten, muss das RPE vor dem Experimentieren monatelang auf bestimmten Substraten in bestimmten Medien gezüchtet werden. Unter diesen Bedingungen sind RPE-Kulturen maximal differenziert und polarisiert, was sich dem in vivo RPE annähert. Leider gibt es derzeit keine Geräte, die den mitochondrialen Stoffwechsel spezifisch aus dem RPE in vivo messen können. Während die Sauerstoffüberwachung des retinalen Kapillarnetzwerks in vivo mit Hilfe der Elektronen-Paramagnetischen Resonanz (EPR)-Oximetrie8 durchgeführt wurde, ist dies bei der RPE-Analyse nicht möglich. Unterschiede zwischen dem RPE-Metabolismus in vivo und in vitro sind nicht gut beschrieben, aber es wurde gezeigt, dass RPE-Kulturen eine hohe mitochondriale Aktivität aufweisen, ähnlich wie RPE in vivo 3,9, was darauf hindeutet, dass mit Hilfe von High-Fidelity-RPE-Kulturen signifikante Einblicke in den mitochondrialen RPE-Stoffwechsel gewonnen werden können.

Da jeder mitochondriale Stoffwechsel zu einem Sauerstoffverbrauch führt, ist die Messung der RPE-Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) ein zuverlässiger Indikator für den mitochondrialen Stoffwechsel. Die Messung von OCR in RPE-Kulturen erwies sich als schwierig, da die Bedingungen, die eine maximale RPE-Polarisation und -Differenzierung begünstigen, mit derzeit verfügbaren Techniken wie dem Seahorse Analyzer oft langfristige genaue OCR-Messungen ausschließen. In diesem Methodenpapier wird ein neuartiges Gerät, der Resipher (im Folgenden als “das System” bezeichnet), vorgestellt, das eine kontinuierliche Messung der OCR über Wochen in RPE ermöglicht, die unter Bedingungen angebaut werden, die die Polarisation und Differenzierung maximal fördern. Die Leichtigkeit, mit der OCR von diesem System unter RPE-Kulturbedingungen gemessen werden kann, die die RPE-Differenzierung und Polarisation maximal fördern, ist einzigartig unter den bestehenden OCR-Messgeräten.

Dieses Dokument enthält Tipps und Tricks für die Verwendung des Systems mit RPE-Kulturen, gefolgt von einer Demonstration von zwei speziellen Anwendungen. Erstens wird die RPE-EMT, die den PVR nachahmt, durch das Engagement gegenüber dem transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGFβ)1,10,11,12 ausgelöst. Das System wird verwendet, um zu überwachen, wie sich der RPE-Stoffwechsel während des EMT-Prozesses entwickelt. Zweitens wird die Rolle von Hypoxie im RPE-Stoffwechsel anhand dieses Systems untersucht. Hypoxie ist ein wichtiger Faktor für die Pathogenese der AMD, da die Choriokapillaris mit dem Altervon 13,14 Jahren dünner wird. Die Kombination dieses Systems mit Hypoxiekammern ermöglicht es, den veränderten mitochondrialen RPE-Stoffwechsel mit der subtilen Hypoxie, die mit dem Altern einhergeht, zu modellieren. Schließlich wird ein Online-Rechner mit Resipher-Daten eingeführt, mit dem man bestimmen kann, ob sich RPE-Kulturen in hypoxischen, normoxischen oder hyperoxischen Bedingungen befinden. Solche Informationen sind entscheidend, um Rückschlüsse auf den RPE-Metabolismus aus In-vitro-RPE-Kulturstudien zu ziehen.

Protocol

Für Protokolle zur Etablierung von humanen Primär- oder iPSC-RPE-Kulturen siehe die folgenden Referenzen 15,16,17,18. Die Gewinnung und Verwendung von menschlichem Gewebe für diese Protokolle wurde vom Institutional Review Board (HUM00105486 der University of Michigan geprüft und genehmigt. 1. Allgemeine Anwendung des Systems auf die RPE-Kultur…

Representative Results

Der “Sandwich”-Aufbau für das Resipher-Experiment ist in Abbildung 2A dargestellt. Sensordeckel mit 32 Sonden, die den Spalten 3, 4, 9 und 10 auf der 96-Well-Platte entsprechen, befinden sich zwischen der Zellplatte und dem Gerät. Nach dem Anschließen an die Nabe aktiviert das Gerät Motoren, um den Sensordeckel auf und ab zu bewegen und dieO2-Konzentration in der Mediensäule in einem Höhenbereich über der Zellen-Monoschicht (typischerweise 1-1,5 mm) zu messen. DerO2-Gr…

Discussion

Der mitochondriale Metabolismus des RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese häufiger erblindender Netzhauterkrankungen, einschließlich AMD und PVR. Die Modellierung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels in vitro ermöglicht es, seinen Stoffwechselzustand von dem des umgebenden Gewebes zu isolieren und das Gewebe auf kontrollierte Weise verschiedenen krankheitssimulierenden Beleidigungen auszusetzen. Eine solche in vitro-Modellierung des mitochondrialen RPE-Stoffwechsels wurde durch das…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Daniel Hass und Jim Hurley für die Idee, die Löslichkeit von O2 in neuen versus konditionierten Medien als Kontrolle zu testen. Wir danken Dr. Magali Saint-Geniez für die redaktionelle Mitarbeit an dem Manuskript. Wir danken Scott Szalay von Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, für die Nachrüstung der Hypoxiekammer mit dem Resipher USB-Kabel. Für die HFT-Forschung wurden keine Bundesmittel verwendet. Der Electronic Services Core wird durch P30 EY007003 des National Eye Institute unterstützt. Diese Arbeit wird durch ein uneingeschränktes Department-Grant von Research to Prevent Blindness (RPB) unterstützt. J.M.L.M. wird unterstützt von der James Grosfeld Initiative for Dry Age-Related Macular Degeneration, der E. Matilda Ziegler Foundation for the Blind, einem Eversight Eye-Bank Grant, einem K08EY033420 Grant des National Eye Institute und Unterstützung von Dee und Dickson Brown sowie der David and Lisa Drews Discovering Hope Foundation. D.Y.S. wird vom UNSW Scientia Programm unterstützt. L.A.K. wird unterstützt durch den Iraty Award, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, ein R01EY027739 Stipendium des National Eye Institute und das Department of Defense Army Medical Research Acquisition Activity VR220059.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Gibco #25-200-056
3,3',5-triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma T5516
32-channel Resipher lid Lucid Scientific NS32-101A for Falcon
Antimycin A from streptomyces sp. Sigma A8674-25MG Inhibitor of Complex III of the electron transport chain
BAM15 Sigma SML1760-5MG Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
DMSO, cell culture grade Sigma-aldrich D4540-100ML Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs
Extracellular matrix coating substrates:
Synthemax II-SC
Corning #3535 Extracellular matrix for hfRPE
Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin Gibco A14700 Extracellular matrix for iPSC-RPE
FCCP Sigma C2920-10MG Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration
Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H) Bio-Techne S11550H
Hydrocortisone-Cyclodextrin Sigma H0396
Hypoxia chamber Embrient Inc. MIC-101
N1 Media Supplement Sigma N6530
Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
O2 sensor Sensit technology or Forensics Detectors P100 or FD-90A-O2
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Recombinant human TGFβ2 Peprotech 100-35B Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition
Rotenone Sigma R8875-1G Inhibitor of Complex I of the electron transport chain
System-compatible plate Corning #353072
Taurine Sigma T8691
αMEM (Alpha Modification of Eagle's Media) Corning 15-012-CV

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Zhang, Q., Shu, D. Y., Bryan, R. A., Han, J. Y. S., Gulette, G. A., Lo, K., Kim, L. A., Miller, J. M. L. Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (210), e67038, doi:10.3791/67038 (2024).

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