Summary

Quantitative Analyse von Vitamin-A-Metaboliten in okulärem und nicht-okulärem Gewebe von Mäusen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Published: December 27, 2024
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Summary

Hier wird ein Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographieverfahren beschrieben, um kritische Retinoide zu detektieren und zu quantifizieren, die an der Erleichterung der Sehfunktion sowohl im Augengewebe als auch im systemischen Gewebe beteiligt sind, im Rahmen der systemischen Vitamin-A-Versorgung zur Erzeugung des essentiellen lichtempfindlichen Rhodopsin-Chromophors 11-cis-Retinal.

Abstract

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine Superfamilie von Transmembranproteinen, die Signalkaskaden durch Aktivierung ihres G-Proteins bei Assoziation mit ihrem Liganden auslösen. In der Sicht aller Säugetiere ist Rhodopsin das GPCR, das für die Initiierung der Phototransduktionskaskade verantwortlich ist. Innerhalb der Photorezeptoren ist Rhodopsin an sein Chromophor 11-cis-Retinal gebunden und wird durch die lichtempfindliche Isomerisierung von 11-cis-Retinal zu all-trans-Retinal aktiviert, wodurch das Transducin-G-Protein aktiviert wird, was zur Phototransduktionskaskade führt.

Während die Phototransduktion gut verstanden ist, sind die Prozesse, die an der Versorgung mit Vitamin-A-Vorläufern in der Nahrung für die 11-cis-Retinal-Bildung im Auge beteiligt sind, sowie Krankheiten, die zu einer Störung dieser Versorgung führen, noch nicht vollständig verstanden. Sobald Vitamin-A-Vorläufer in den Darm aufgenommen wurden, werden sie in der Leber als Retinylester gespeichert und als All-trans-Retinol, das an das Retinol-bindende Protein 4 (RBP4) gebunden ist, in den Blutkreislauf abgegeben. Dieses zirkulatorische RBP4-Retinol wird von systemischen Organen wie Leber, Lunge, Niere und Auge aufgenommen. Daher ist eine Methode zur Quantifizierung der verschiedenen Metaboliten von Vitamin A in der Nahrung im Auge und in den systemischen Organen von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung der ordnungsgemäßen Funktion von Rhodopsin GPCR.

In dieser Methode stellen wir eine umfassende Extraktions- und Analysemethode für die Vitamin-A-Analytik in murinem Gewebe vor. Durch die Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie können alle relevanten Isomere von Retinaldehyden, Retinolen und Retinylestern gleichzeitig in einem einzigen Lauf nachgewiesen werden, was die effiziente Verwendung von Versuchsproben ermöglicht und die interne Zuverlässigkeit verschiedener Vitamin-A-Metaboliten innerhalb derselben Probe erhöht. Mit dieser umfassenden Methode werden die Forscher in der Lage sein, die systemische Vitamin-A-Versorgung in der GPCR-Funktion von Rhodopsin besser zu beurteilen.

Introduction

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine der am besten untersuchten und charakterisierten Superfamilien von bekannten Proteinen. In ihrer bekanntesten Funktion dienen GPCRs als Zelloberflächenrezeptor bei der Signaltransduktion und initialisieren intrazelluläre Reaktionen bei der Bindung an einen bestimmten Liganden. GPCRs zeichnen sich durch sieben helikale Transmembrandomänen (TM) und sechs Gesamtschleifendomänen aus. Von den sechs Schleifen sind drei Schleifen extrazellulär orientiert, um die Ligandenbindung zu erleichtern, während die anderen drei intrazellulären Schleifen an ein heterotrimeres G-Protein gekoppelt sind, das aus den Untereinheiten Gα, Gβ und Gγbesteht 1,2.

GPCRs werden in mehrere Klassen eingeteilt, darunter Rhodopsin-ähnliche Klassen der Klasse A, Klasse-B-Secretin-Rezeptorfamilie, Klasse-C-Glutamat, Klasse-D-Pilzpaarungs-Pheromonrezeptoren, zyklische AMP-Rezeptoren der Klasse E und Klasse F gekräuselte/geglättete 3,4. Wie der Name schon sagt, umfasst die GPCR-Rhodopsin-ähnliche Unterklasse der Klasse A Rhodopsin, das kritische GPCR, das für die Phototransduktion und die Sehfunktion verantwortlich ist. Rhodopsin enthält alle relevanten Schlüsselmerkmale und Strukturelemente, die im kanonischen Modell der GPCRs zu finden sind, einschließlich der zuvor erwähnten sieben helikalen TM-Domänen, der sechs extrazellulären und intrazellulären Schleifen und der Assoziation mit einem heterotrimeren G-Protein, das auch als Transducin (G t) in den Photorezeptoren bekanntist 1,5,6,7. Innerhalb der Bindungstasche von Rhodopsin bindet 11-cis-Retinal, der lichtempfindliche Chromophor-Ligand, über eine kovalente Schiff-Basenbindung an Rhodopsin an Lysin 296 und bildet so 11-cis-Retinyliden 1,8. Bei der Absorption eines Photons wird 11-cis-Retinyliden zu all-trans-Retinyliden photoisomerisiert, wodurch eine Konformationsänderung innerhalb von Rhodopsin induziert wird. Daher ist der 11-cis-retinale Ligand entscheidend für die Funktion des Rhodopsin-GPCR, und eine robuste und effiziente Versorgung mit 11-cis-Retinal muss kontinuierlich aufrechterhalten werden, um die hohe Umsatzrate innerhalb der Photorezeptoren zu überwinden.

Retinaldehyde wie 11-cis-Retinal gehören zu einer Gruppe von Molekülen, die zusammen als Retinoide bezeichnet werden, und biologisch relevante Retinoide werden allgemein als Vitamin A bezeichnet. Retinoide zeichnen sich durch eine zyklische Endgruppe aus, die mit einer konjugierten Polyenkette verbunden ist, mit einer polaren Endgruppe am anderen Ende. Retinaldehyde und assoziierte Vitamere des Vitamin A sind keine Ausnahme von dieser Charakterisierung, die den β-Ionon-Ring als cyclische Endgruppe, eine Diterpen-Polyen-Kette und eine je nach Vitamer unterschiedliche polare Endgruppe enthalten, d.h. Aldehydgruppe für Retinaldehyde, Hydroxylgruppe für Retinole, Carboxylgruppe für Retinsäuren, Esterbindung für Retinylester, usw. (Abbildung 1)9,10.

Säugetiere können Vitamin A nicht de novo synthetisieren, Pflanzen jedoch schon; Daher müssen alle Retinoide in Säugetiersystemen aus der Ernährung pflanzlicher Produzenten bis zu den Verbrauchern in der Nahrungskette stammen. Im kanonischen Modell des Vitamin-A-Stoffwechsels wird β-Carotin, das archetypische pflanzliche Provitamin A, über den Scavenger-Rezeptor der Klasse B, Mitglied 1 (SCARB1) in die Darm-Enterozyten aufgenommen, das durch β-Carotin-Oxygenase 1 (BCO1/BCMO1) in zwei Moleküle von all-trans-Retinal gespalten wird, das an das Retinaldehyd-bindende Protein 2 (RBP2) bindet und zu all-trans reduziert wird-Retinol durch Retinol-Dehydrogenasen (RDH), umgewandelt durch Lecithin-Retinol-Acyltransferase (LRAT) in Retinylester und dann in den Blutkreislauf in Chylomikron 11,12,13,14. Retinylester, wie z.B. Retinylpalmitat, dienen hingegen als vorherrschendes Provitamin A aus tierischen Quellen. Retinylpalmitat aus dem Darmlumen wird durch die Carboxylesterase 1 (CES1) zu all-trans-Retinol hydrolysiert und diffundiert in den intestinalen Enterozyten15. Die Leber ist das primäre Speicher- und homöostatische Organ für die Vitamin-A-Homöostase, die die Retinylester in diesen Chylomikronen absorbiert, die durch Retinylester-Hydrolasen zu all-trans-Retinol hydrolysiert werden, das an das zelluläre Retinol-bindende Protein 1 (CRBP1) gebunden ist, in hepatische Sternzellen eindringt und von LRAT zur Lagerung wieder in Retinylester umgewandeltwird 13,16, 17. Urheberrecht Um einen homöostatischen Vitamin-A-Spiegel im Organismus aufrechtzuerhalten, setzt die Leber Vitamin A in Form von all-trans-Retinol frei, das an einen Serumtransportkomplex gebunden ist, der aus dem Retinol-bindenden Protein 4 (RBP4) und Transthyretin (TTR) besteht15,18,19. Dieser Komplex wird in diesem Manuskript als Holo-RBP4 bezeichnet.

Um diese systemische Vitamin-A-Versorgung im Blut nutzen zu können, muss systemisches Gewebe, einschließlich des Augengewebes, in dem eine robuste Vitamin-A-Quelle aufrechterhalten wird, über eine Methode zur Aufnahme von Holo-RBP4 in das Gewebe verfügen. In der photorezeptorreichen Netzhaut im Augengewebe ist der durch Retinsäure 6 (STRA6) stimulierte Membranrezeptor der Transporter, der an dieser Funktion beteiligt ist. In mechanistischen Studien wurde gezeigt, dass STRA6 in der Lage ist, die Aufnahme von extrazellulärem all-trans-Retinol aus Holo-RBP4 in das RPE20 zu erleichtern. Dieses importierte all-trans-Retinol tritt dann in den visuellen Zyklus ein, d. h. in den Prozess, durch den all-trans-Retinol innerhalb des RPE und des äußeren Photorezeptorsegments in 11-cis-Retinal umgewandelt wird, wodurch die Sehfunktion erleichtert wird, wenn es an Rhodopsin 9,21 gebunden ist.

Sobald all-trans-Retinol aus zirkulatorischem Holo-RBP4 über STRA6 die Blut-Netzhaut-Schranke in das RPE im Augengewebe überquert, wird all-trans-Retinol im RPE zunächst durch LRAT zu Retinylester verestert und dann durch das retinale Pigmentepithel-spezifische 65-kDa-Protein (RPE65) zu 11-cis-Retinol hydrolysiert. 11-cis-Retinol wird dann durch die Retinol-Dehydrogenase 5 in 11-cis-Retinal umgewandelt. Dieses 11-cis-Retinal wird dann durch das Interphotorezeptor-Retinoid-bindende Protein (IRBP) in das äußere Segment (OS) des Photorezeptors transportiert9,21. Im endoplasmatischen Retikulum, das den Photorezeptorkern innerhalb der äußeren Kernschicht (ONL) umgibt, werden die Opsin-GPCRs synthetisiert und über das verbindende Zilium (CC) transportiert. Die Motorproteine, die an diesem Transport durch das CC beteiligt sind, sind umstritten, aber aktuelle Hypothesen implizieren, dass der Intraflagellentransport (IFT) von Kinesin und Dynein oder der Myosin-basierte Transport wahrscheinlich die Ursache für diesen Prozess sind 14,22,23,24,25,26. Sobald diese beiden Komponenten in den membranösen Scheiben innerhalb des OS aufeinandertreffen, bilden 11-cis-Retinal und Opsin 11-cis-Retinyliden durch eine kovalente Bindung der Schiff-Base an Lysin 196 auf Rhodopsin, bereit für die Phototransduktion8.

Während die Expression von STRA6 im RPE der Netzhaut die Aufnahme von all-trans-Retinol aus Holo-RBP4 erleichtert, wurde festgestellt, dass STRA6 in der Leber nicht exprimiert wird, obwohl es als primäres homöostatisches Organ für Vitamin A fungiert und Fähigkeiten bei der Aufnahme von all-trans-Retinol aus Holo-RBP4 aufweist 15,19,27,28, 29,30,31. Schließlich wurde ein analoger Rezeptor namens Retinol-bindender Protein-4-Rezeptor 2 (RBPR2) entdeckt, der die Fähigkeit zeigt, all-trans-Retinol aus Holo-RBP4 aufzunehmen, ähnlich wie STRA6, aber im Lebergewebe exprimiertwird 32.

Daher erfordert ein vollständiges Verständnis der Rolle von Rhodopsin für die Sehfunktion ein Verständnis der biologischen Prozesse, die in der Regeneration des Sehpigments gipfeln. Dies steht wiederum in engem Zusammenhang mit den zuvor beschriebenen Prozessen, einschließlich des Metabolismus von Provitamin-A-Vorläufern, der Speicherung in der Leber, der Freisetzung von Holo-RBP4 durch die Leber und der eventuellen Aufnahme von Holo-RBP4 durch STRA6- und RBPR2-Membranrezeptoren. Wie oben erwähnt, sind Tiermodelle wie Mäuse nach wie vor eines der führenden Modelle bei der Erforschung solcher Prozesse. Daher möchten wir eine Extraktionsmethode für Retinoide in murinem Gewebe vorstellen, sowie eine Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Methode, mit der diese Retinoide nachgewiesen und quantifiziert werden können. Mit diesen Methoden können die oben beschriebenen wichtigen Retinoide, wie z.B. der 11-cis-retinale Rhodopsin-Ligand oder das Haupttransportretinoid all-trans-Retinol, in okulären, hepatischen und systemischen Organen analysiert werden. Durch die Bewertung der Retinoidversorgung in murinem Gewebe kann unser Verständnis der Krankheitszustände und Pathologien im Zusammenhang mit der logistischen Versorgung mit Retinoiden weiter verbessert werden.

Neben ihrer Funktion als Chromophor in der visuellen Funktion durch Assoziation mit Opsin-GPCRs spielen Retinoide auch eine wichtige Rolle bei der Signalübertragung von Säugetierzellen durch Retinsäure-Signalwege, die durch zwei Familien von Kernrezeptoren erleichtert werden, Retinsäurerezeptoren (RARs) und Retinoid-X-Rezeptoren (RXRs), die direkt an die DNA binden und die Gentranskription regulieren33. Diese beiden Familien oder Rezeptoren verwenden beide Retinoide in Form von Retinsäuren als Liganden. Es wurde gezeigt, dass RARs eine Affinität sowohl für all-trans-Retinsäure als auch für 9-cis-Retinsäure aufweisen, während RXRs eine Affinität für nur 9-cis-Retinsäure aufweisen34,35. Retinsäuren in unkontrollierten Mengen sind teratogen, und die Retinsäure-Signalübertragung muss extrem streng kontrolliert werden36. Die Produktion von Retinsäuren für die Signalübertragung muss lokal und zu sehr spezifischen Zeitpunkten erfolgen, um die richtige Entwicklung von Geweben zu gewährleisten, wie z. B. bei der Entwicklung des Hinterhirns und der Gliedmaßen, aber unzählige andere Beispiele nutzen die Retinsäure-Signalgebung37,38. In Zellen, die an der Retinsäure-Signalübertragung beteiligt sind, werden Retinsäuren durch zwei Gruppen von Enzymen synthetisiert: Alkohol/Retinol-Dehydrogenasen (ADHs/RDHs), die die Oxidation von Retinolen, die von STRA6 oder RBPR2 aufgenommen werden, zu Retinaldehyden erleichtern, und Retinaldehyd-Dehydrogenasen (RALDHs), die die Oxidation von Retinaldehyden zu Retinsäuren erleichtern39. Obwohl Retinsäuren nicht an der GPCR-Signalübertragung an sich beteiligt sind, stellen sie dennoch ein wichtiges Retinoid dar, das auch als Ligand für Signalrezeptoren fungiert.

Auch wenn hier nicht näher beschrieben, möchten wir die bisher etablierten Methoden zum Retinoid-Nachweis mittels HPLC in verschiedenen Kontexten, wie z.B. in der Lebensmittelforschung und der Erforschung von mikrobiellem Rhodopsin, würdigen. Diese Methoden verfolgen unterschiedliche Ziele und Ansätze für den Retinoid-Nachweis, einschließlich der Verwendung von Umkehrphasentechniken, die weniger flüchtige und gefährliche mobile Phasen erfordern 40,41,42, des Nachweises von Retinsäuren und ihrer zugehörigen Isomere40,41 sowie der Reinigung und Extraktion aus verschiedenen biologischen Quellen43. Unsere Methode konzentriert sich speziell auf den Nachweis von Retinylpalmitat, Retinaldehyd-Isomeren und Retinol-Isomeren aus Säugetiergewebe. Unterschiedliche Protokolle sollten in Betracht gezogen werden, wenn sich der vorgesehene Anwendungsfall von dieser speziellen Anwendung unterscheidet.

Protocol

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota (Protokoll # 2312-41637A) genehmigt und in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt. Führen Sie alle Extraktionen im Dunkeln unter einem schwachen roten Licht zur Beleuchtung durch. Achten Sie auf das Restlicht, das von Instrumentendisplays und Zubehör-LEDs abgegeben wird. <p class="jove_tit…

Representative Results

Hier haben wir die oben beschriebene Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Retinoiden in murinem okulärem und systemischem Gewebe verwendet und repräsentative Chromatogramme erstellt. Zusätzlich geben wir eine Zusammenfassung der typischen Retinoide, die in diesen Geweben nachgewiesen werden können. Im Alter von 6 Monaten wurden die Mäuse durch CO2 -Erstickung eingeschläfert. Um den okulären Retinoidgehalt aufrechtzuerhalten, wurde…

Discussion

Bei dieser Methode wird die Normalphasen-HPLC verwendet, um relevante Retinoide, einschließlich Retinylester, Retinaldehyde und Retinole, nachzuweisen und zu quantifizieren. Angesichts der Bedeutung von 11-cis-Retinal als kritischem Chromophor bei der Aktivierung des Rhodopsin-GPCR ist eine Methode, die die Metaboliten nachweisen kann, die mit der Produktion von 11-cis-Retinal in Verbindung stehen, entscheidend für die Untersuchung der gesamten Sehfunktion. Der Hauptv…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch NIH-NEI-Zuschüsse (EY030889 und 3R01EY030889-03S1) und teilweise durch die Startkapitalhilfe der University of Minnesota für G.P.L. unterstützt. Wir möchten uns auch beim National Eye Institute für die Bereitstellung des in diesem Manuskript verwendeten 11-cis-Retinal-Standards bedanken.

Materials

Reagent
1-Octanol, suitable for HPLC, ≥99.5% Sigma-Aldrich, Millipore Sigma 203-917-6
1,4-Dioxane, suitable for HPLC, ≥99.5% Sigma-Aldrich, Millipore Sigma 204-661-8
11-cis-retinal National Eye Institute N/A
11-cis-Retinol Toronto Research Chemicals TRC-R252105
13-cis-retinal Toronto Research Chemicals TRC-R239900
13-cis-retinol Toronto Research Chemicals TRC-R252110
All-trans-Retinal Toronto Research Chemicals TRC-R240000
All-trans-Retinol Toronto Research Chemicals TRC-R252002
Ethyl Acetate, suitable for HPLC, ≥99.7% Sigma-Aldrich, Millipore Sigma 205-500-4
Hexane, HPLC Grade Fisher Scientific, Spectrum Chemical 18-610-808
Methanol (HPLC) Fisher Scienctific A452SK-4
Retinyl Palmitate Toronto Research Chemicals TRC-R275450
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Scientific S271-500
Instruments
1260 Infinity II Analytical Fraction Collector Agilent G1364F
1260 Infinity II Binary Pump Agilent G7112B
1260 Infinity II Diode Array Detector Agilent G7115A
1260 Infinity II Multicolumn Thermostat Agilent G7116A
1260 Infinity II Vialsampler Agilent G7129A
ST40R Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TSST40R
Vacufuge Plus Centrifuge Concentrator Eppendorf 22820168
Consumables
2 mL Amber Screw Top Vials Agilent 5188-6535
Crimp Cap with PTFE/red rubber septa, 11 mm Agilent 5183-4498
Disposable Glass Conical Centrifuge Tubes Millipore Sigma CLS9950215
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Vial insert, 150 µL, glass with polymer feet Agilent 5183-2088

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Leung, M., Radhakrishnan, R., Lor, A., Li, D., Yochim, D., More, S., Lobo, G. P. Quantitative Analysis of Dietary Vitamin A Metabolites in Murine Ocular and Non-Ocular Tissues Using High-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (214), e67034, doi:10.3791/67034 (2024).

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