Hier zeigen wir, dass Hochleistungslaser 375 nm und 405 nm Laser Hoechst 33342 effektiv anregen und als praktikable Alternative zum 355 nm Laser für die Detektion von Seitenpopulationszellen (SP) dienen können, wodurch das Spektrum der verfügbaren Laser in der Durchflusszytometrie erweitert wird.
Die Zellen der Seitenpopulation (SP) werden durch Hoechst 33342-Färbung identifiziert und mittels Durchflusszytometrie (FCM) analysiert. Das Hoechst SP-Verfahren wird für die Isolierung von Stammzellen auf der Grundlage der Farbstoffausflusseigenschaften von ATP-bindenden Kassette (ABC)-Transportern eingesetzt. Die Methode wurde ursprünglich für die Identifizierung und Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) eingesetzt, hat sich aber weiterentwickelt und konzentriert sich nun hauptsächlich auf die Identifizierung und Isolierung von Krebsstammzellen (CSCs). Bei der traditionellen Detektionsmethode von FCM wird ein 355-nm-Laser verwendet, um den Farbstoff zum Nachweis von SP-Zellen anzuregen. Durch diese Studie ist es uns gelungen, alternative Ansätze zur Farbstoffanregung zu identifizieren, die die Detektion von SP-Zellen mit einem 355-nm-Laser effektiv ersetzen können. Dies wird durch den Einsatz von Hochleistungslasern mit 375 nm oder 405 nm erreicht. Dies ermöglicht es uns, eine verbesserte Selektivität bei der Detektion von SP-Zellen auszuüben, anstatt nur auf die 355-nm-Laser-Durchflusszytometrie beschränkt zu sein.
Die Zellen der Seitenpopulation (SP) werden durch Hoechst 33342-Färbung identifiziert und mittels Durchflusszytometrie (FCM) analysiert. Die SP-Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass der fluoreszierende DNA-Farbstoff durch ihren ATP-bindenden Kassettentransporter(ABC) 1,2 aus den Zellen gepumpt wird. Die Methode wurde ursprünglich für die Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) des murinen Knochenmarks etabliert1. Die Knochenmark-SP-Zellen wurden mit einer Population von HSCs angereichert, die durch eineniedrige CD117+Sca-1+Lin-Thy1-Expression gekennzeichnet waren 3,4. Danach wurde die Methode häufig verwendet, um Stammzellen aus anderen Geweben zu isolieren und anzureichern, darunter Herzmuskel5, Leber6, Lunge7, Niere8 und Vorderhirn9. Insbesondere wurde die Methode in den letzten zehn Jahren zur Isolierung von Krebsstammzellen (CSCs) angewendet. CSCs stellen eine kleine Population von Zellen dar, die die Eigenschaften der Tumorinitiierung, der Selbsterneuerung, der Resistenz gegen Chemotherapie und des Metastasierungspotenzials besitzen10. CSCs wurden zunächst bei hämatopoetischen Malignomen11 identifiziert und anschließend bei verschiedenen soliden Tumoren wie Prostata12, Eierstock13, Magen14, Brust15 und Lunge16 beobachtet. Trotz der Verfügbarkeit verschiedener Techniken zur CSC-Identifizierung bleibt die SP-Technik aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit in verschiedenen Geweben und Zelllinien eine bevorzugte Wahl. Darüber hinaus ist es eine wertvolle Technik zur Isolierung von CSCs mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)16,17,18. Die experimentellen Befunde zeigen, dass SP-Zellen eine ausgeprägte Tumorigenität aufweisen und erhöhte Expressionsniveaus von Stammzell-assoziierten Genen aufweisen19,20. Unsere vorherige Studie21 hat auch gezeigt, dass die transkriptomische Analyse isolierter SP-Zellen beim Multiplen Myelom eine Anreicherung von Signalwegen zeigt, die mit Stammzellen assoziiert sind, wie z. B. dem Hedgehog-Signalweg. In der Zwischenzeit führten wir Signalanreicherungsanalysen an den Genen durch, die in den SP-Zellen der akuten myeloischen Leukämie unterschiedlich exprimiert werden22. Die veränderten Gene wurden in stammzellbezogenen Signalwegen angereichert (Wnt/β-Catenin, TGF-β, Hedgehog, Notch). Wir fanden heraus, dass 1 x 105 SP-Zellen Tumore in BALB/c-Null-Mäusen bilden konnten22, während Nicht-SP-Zellen dies nicht konnten, was darauf hindeutet, dass SP-Zellen Eigenschaften von Leukämie-Stammzellen aufwiesen. Die Wirksamkeit der Hoechst SP-Methode bei der Identifizierung von CSCs ist offensichtlich.
Das Hoechst SP-Protokoll wurde im Laufe der Forschung verfeinert und verbessert. Das Protokoll beinhaltet eine strenge Kontrolle der Farbstoffkonzentration, der Zelldichte, der Inkubationstemperatur und -dauer, der Pufferzusammensetzung und des pH-Wertes. Die nach diesem Protokoll vorbereiteten Zellproben wurden einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen. Aufgrund der Anregung des Hoechst-Farbstoffs mit einem UV-Laser bei 355 nm und der Detektion seiner Fluoreszenzemission sowohl mit einem 690/50 nm Filter (Hoechst Red) als auch mit einem 450/50 nm Filter (Hoechst Blue) ist für FCM ein 350 nm Laser erforderlich. 350-nm-Laser sind jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten in den meisten FCMs nicht üblich. Daher haben wir versucht, einen alternativen Ansatz zur Farbstoffanregung für den effektiven Nachweis von SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie zu finden. In dieser Studie wurde die Fähigkeit der 375-nm- und 405-nm-Laser zur Detektion von SP-Zellen bewertet und mit der des 355-nm-Lasers verglichen. Unsere Ergebnisse zeigen eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen den SP-Zellen, die von den 355-nm-, 375-nm- und 405-nm-Lasern detektiert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hochleistungslaser 375 nm und 405 nm als praktikable Alternativen zu den 355 nm Lasern für die SP-Zelldetektion dienen können. Die Einbeziehung zusätzlicher Anregungslichtquellen für Hoechst 33342 ermöglicht die Verwendung weiterer Durchflusszytometrie-Modelle.
Wir verwendeten das beschriebene Protokoll, um drei Experimente durchzuführen, wobei jeder Versuch 3-4 Mäuse umfasste, was zu insgesamt 10 Mäusen führte. Der Anteil der SP-Zellen lag zwischen 0,05 % und 0,76 %. Es ist wichtig zu beachten, dass bei den Mäusen individuelle Unterschiede beobachtet wurden. Wir setzten vier Durchflusszytometer ein, um die Hoechst-Proben zu analysieren. Es wird beobachtet, dass die Anregung des Hoechst-Farbstoffs durch einen 20 mW 355 nm Laser auf der neuen Version der Durchflusszytometri…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81800207) an J.H. unterstützt. Wir wissen die Unterstützung von Beckman Coulter, Inc. bei der Durchflusszytometrie und Parameterkalibrierung sehr zu schätzen. Wir danken Jiao Chen vom State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, und Yu Qi vom Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University, für ihre Unterstützung bei der Datenerfassung in der Durchflusszytometrie.
Automatic cell counter | Countstar | 1M1200 | |
Cell Filter(100 µm) | BIOFIL | CSS-013-100 | |
Daily quality control fluorospheres | Beckman Coulter | B5230 | |
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium) | CORNING | 10-013-CVRC | |
Fetal bovine serum | CORNING | 35-081-CV | |
HBSS | Hyclone | SH30030.02 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
Red blood cell lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |