Fortschritte in der Rinder-Organoid-Technologie unter Verwendung von Dünn- und Dickdarm-Monolayer-Grenzflächen
Summary
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Generierung von 2D-Monoschichten des Rinderdarms aus Organoiden vor, das einen verbesserten Zugang zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen bietet. Es umfasst Methoden zur Bewertung der Membranintegrität und -funktionalität und entwickelt In-vitro-Modelle weiter, die die Magen-Darm-Physiologie von Rindern nachahmen. Dieser Ansatz verspricht erhebliche biomedizinische und landwirtschaftliche Vorteile, einschließlich verbesserter Behandlungsstrategien.
Abstract
Der Fortschritt des Wissens über die gastrointestinale Physiologie und ihre Erkrankungen hängt entscheidend von der Entwicklung präziser, speziesspezifischer In-vitro-Modelle ab, die In-vivo-Darmgewebe originalgetreu nachahmen. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen bei Rindern, die ein bedeutendes Reservoir für Krankheitserreger darstellen, die ein ernsthaftes Risiko für die öffentliche Gesundheit darstellen. Traditionelle 3D-Organoide bieten einen begrenzten Zugang zur apikalen Oberfläche des Darmepithels, eine Hürde, die durch das Aufkommen von 2D-Monolayer-Kulturen überwunden wurde. Diese Kulturen, die aus Organoidzellen gewonnen werden, bieten eine freiliegende luminale Oberfläche für leichter zugängliche Studien. In dieser Forschung wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung und Aufrechterhaltung von 2D-Monolayer-Kulturen aus Zellen von Rinder-Dünn- und Dickdarm-Organoiden vorgestellt. Diese Methode umfasst Protokolle zur Beurteilung der Membranintegrität durch den transepithelialen elektrischen Widerstand und die parazelluläre Permeabilität sowie immunzytochemische Färbetechniken. Diese Protokolle legen den Grundstein für die Etablierung und Charakterisierung eines 2D-Monolayer-Kultursystems für Rinder und verschieben die Grenzen dieser Methodenanwendungen in der biomedizinischen und translationalen Forschung von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Der Einsatz dieses innovativen Ansatzes ermöglicht die Entwicklung physiologisch relevanter in vitro Modelle zur Erforschung sowohl normaler als auch kranker Zustände der Darmphysiologie von Rindern. Die Auswirkungen auf die biomedizinischen und landwirtschaftlichen Fortschritte sind tiefgreifend und ebnen den Weg für wirksamere Behandlungen von Darmerkrankungen bei Rindern, wodurch sowohl der Tierschutz als auch die Lebensmittelsicherheit verbessert werden.
Introduction
Die Kultivierung von Darmepithelstammzellen in dreidimensionalen (3D) Kulturen, den sogenannten Darmorganoiden, stellt einen bedeutenden Fortschritt in der In-vitro-Technologie zur Untersuchung von Darmfunktionen, Ernährung und Wechselwirkungen mit Krankheitserregern dar 1,2. Diese Organoide ahmen die komplexe Struktur des In-vivo-Darmepithels nach, indem sie sich selbst replizieren und sich in 3D-Formationen organisieren, die verschiedene Darmzelllinien umfassen3. Dieses Merkmal unterstreicht ihr erhebliches Potenzial, das Verständnis der Darmbiologie voranzutreiben.
Das zunehmende Interesse an der Anwendung der Darmorganoid-Technologie bei Nutztieren erfordert die Verfeinerung der Kultur- und Erhaltungstechniken 4,5. Die Bedeutung dieser Technologie wird durch ihre potenziellen Auswirkungen auf die Erforschung der Darmgesundheit von Nutztieren unterstrichen, die eine entscheidende Rolle für ihre Produktivität und damit für die Wirtschaftlichkeit der Lebensmittel- und Tierindustrie spielt, indem sie den Tierschutz und die Betriebskosten beeinflusst 6,7. Insbesondere ist der Einsatz von Darmorganoidkulturen zur Erforschung der Darmfunktion von Rindern von größter Bedeutung, da sie als Reservoire für zoonotische enterische Krankheitserreger wie Salmonella spp. und Escherichia coli (E. coli) O157:H78 dienen. Diese Krankheitserreger sind in bestimmten Segmenten des Darms lokalisiert, so dass es wichtig ist, die Methoden der Darmorganoid-Kultur nach Darmsegmenten zu unterscheiden, um die Genauigkeit in Studien zu erhöhen9.
Ein wesentliches Hindernis bei der Erforschung von Darmorganoiden ist der eingeschränkte Zugang zur apikalen Oberfläche der Epithelzelle10. Wenn die Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECM) kultiviert werden, orientieren sie sich auf natürliche Weise so, dass die Basaloberfläche nach außen zeigt und die apikale Oberfläche nach innen gerichtetist 10. Um dieser Herausforderung zu begegnen, werden Methoden vorgestellt, bei denen 3D-Organoide in einzelne Zellen dissoziiert und in semipermeable Zellkulturinsertionen eingepflanzt werden. Dieser Aufbau stellt eine Grenzfläche zwischen der apikalen Oberfläche und einem basolateralen Kompartiment her. Dieses Protokoll zeigt, dass Zellen, die aus rinderintestinalen Organoiden gewonnen werden, eine kohärente 2D-Monoschicht bilden können, wie Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und parazelluläre Permeabilitätstests belegen. Darüber hinaus wird die Entwicklung einer zellulären Polarität mit Bürstenrändern und Tight Junctions in den aus Organoiden gewonnenen 2D-Monoschichtzellen durch Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie bestätigt, was die Eigenschaften des in vivo Darmepithels widerspiegelt.
In dieser Studie repräsentiert das Ileum den Dünndarmtrakt und das Rektum den Dickdarmtrakt. Diese Selektionen basieren auf relevanten enterischen Krankheitserregern wie Salmonella spp., die das Ileum11 translozieren können, und E. coli O157:H7, von denen bekannt ist, dass sie hauptsächlich das Rektum9 bei Rindern besiedeln. Die Auswahl dieser spezifischen Darmsegmente unterstreicht die Notwendigkeit, die Methoden der Darmorganoid-Kultur auf die Darmregion zuzuschneiden, um die Präzision in der Forschung zu gewährleisten. Diese Methoden beschreiben das Verfahren zur effektiven Kultivierung einer von Organoiden abgeleiteten 2D-Monolayer-Schnittstelle aus diesen Darmsegmenten und bieten ein robustes Modell für die Erforschung der Darmgesundheit von Rindern, Krankheitserregerinfektionen und Wechselwirkungen zwischen dem Darmmikrobiom und dem Wirt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Gesundheit des Darmtrakts ist sowohl für die Produktivität als auch für das allgemeine Wohlbefinden von Rindern von größter Bedeutung16. Durch den Einsatz der von Organoiden abgeleiteten 2D-Monolayer-Technologie können Wissenschaftler nun die komplexe Struktur des Rinderdarmepithels in einer In-vitro-Umgebung genauer nachahmen5. Dieser innovative Ansatz reproduziert nicht nur die vielfältige zelluläre Zusammensetzung der Darmschleimhaut, einschließlich ihrer mehrzelligen Abstammungslinien, sondern erfasst auch wichtige funktionelle Merkmale wie die Schleimsekretion und das Vorhandensein von Mikrovilli, die für das Verständnis der Darmphysiologie und -pathologie unerlässlich sind3. Die Entwicklung maßgeschneiderter Kulturprotokolle für Segmente des Ileums und des Rektums hat zu einer fortschrittlichen Plattform geführt, die die Kapazität zur Untersuchung der Darmgesundheit von Rindern erheblich verbessert. Dieser ausgeklügelte Ansatz ermöglicht detaillierte Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen zoonotischen Erregern und dem Rinderdarmmilieu. Die Möglichkeit, die einzigartigen Aspekte des Ökosystems des Rinderdarms in vitro genau nachzubilden und zu untersuchen, ist ein wichtiger Schritt auf dem Weg zur Entwicklung gezielter Strategien zur Verbesserung der Gesundheit von Nutztieren und zur Eindämmung der Ausbreitung von Zoonosen.
Um jedoch eine erfolgreiche Entwicklung von 2D-Monolayern mit Rinderdarm-Organoiden zu gewährleisten, ist es entscheidend, die Gesundheit und Vitalität sowohl der Organoide als auch ihrer dissoziierten Einzelzellen zu erhalten. Eine sorgfältige Handhabung und die Minimierung von Stress sind von größter Bedeutung, um die Zellintegrität und -funktionalität zu erhalten, die für das effektive Wachstum von Organoiden und die anschließende Schaffung einer funktionierenden Monoschicht unerlässlich sind. Darüber hinaus beruht das Erreichen einer einheitlichen Monoschicht auf der erfolgreichen Dissoziation von Organoiden zu einzelnen Zellen, ohne große Klumpen zu bilden. Solche Klumpen können die Zellverteilung stören und die Struktur der Monoschicht beeinträchtigen. Daher ist der Einsatz präziser Techniken für eine reibungslose Dissoziation von entscheidender Bedeutung, die zu einer konsistenten Einzelzellsuspension führt. Darüber hinaus ist es von Vorteil, Störungen während der Zelladhäsion und beim Ausspülen überschüssiger nicht adhärenter Zellen zu minimieren. Dieser Ansatz ist besonders wichtig, um potenzielle Probleme mit der 3D-Morphogenese zu lösen und so die Gesamtqualität der Monoschicht zu verbessern.
Eine bekannte Herausforderung bei EZM-basierten Hydrogelen, die biologischen Ursprungs sind, ist die Variation der Zusammensetzung von Charge zu Charge17. Obwohl dies bei den beschriebenen Protokollen und Materialien nicht beobachtet wurde, könnten Variationen in der ECM-Zusammensetzung von Charge zu Charge eine Herausforderung für die erfolgreiche Entwicklung von Monolayern darstellen. Wenn die Monolagenbildung durch Änderungen von ECM-Produkten, Marken oder Chargennummern beeinträchtigt wird, können Optimierungsschritte erforderlich sein, um die geeignete ECM-Konzentration zu bestimmen, die für die Beschichtung der Zellkultureinsätze erforderlich ist.
Darüber hinaus ist die Anpassung des Kulturmediums an die Raumtemperatur vor Änderungen ein entscheidender Schritt, der dazu beiträgt, Temperaturschocks zu mildern, die Zellgesundheit zu schützen und die Qualität sowohl der Organoid- als auch der Monolayer-Kulturen zu erhalten. Schonende Waschpraktiken sind auch von größter Bedeutung, um die Integrität der Monoschicht während ihrer Bildung und der nachfolgenden Assays zu erhalten, und die Vermeidung von Unterbrechungen kann Ungenauigkeiten in den Ergebnissen verhindern. Die Substitution von PBS durch Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) erwies sich als hilfreich bei der Minimierung der Monolagenablösung, wenn sie bei wiederholtem Waschen oder längerer Exposition gegenüber PBS zu einem Problem wurde, wie z. B. bei den parazellulären Permeabilitätsassays. Schließlich ist die Anpassung des Kulturmediums an die spezifischen Bedürfnisse von Zellen aus verschiedenen Segmenten des Darmtrakts, wie z. B. dem Ileum und dem Rektum, für eine genaue Replikation von In-vivo-Bedingungen unerlässlich. Diese Spezifität gewährleistet eine optimale Zellgesundheit und -funktionalität und ermöglicht eine präzise Modellierung der Darmphysiologie von Rindern und der Wechselwirkungen mit Krankheitserregern, wodurch diese kritischen Schritte in der Organoidforschung hervorgehoben werden.
Neben der Anwendung einer schonenden Zellhandhabung ist der Aufbau einer guten technischen Kompetenz im Zusammenhang mit Zellzählung und TEER-Messungen entscheidend für die erfolgreiche Entwicklung eines funktionierenden 2D-Monolayers. Denn sowohl zu niedrige als auch zu hohe Aussaatdichten, die aus einer Über- bzw. Unterzählung der Zellen resultieren, können zu einem beeinträchtigten Monolayer-Wachstum führen. Es wird empfohlen, die Zellzahlen sorgfältig zu überprüfen und eine angemessene Aussaatdichte sicherzustellen, wenn der Verdacht auf ungenaue Aussaatdichten besteht. Darüber hinaus können unzureichende TEER-Messtechniken zu einer Störung der Monoschicht durch versehentliche Kratzer mit den Elektroden führen. Das vorsichtige Einbringen der Elektroden in die apikale Kammer und das besondere Achten auf die Beibehaltung ihrer vertikalen Ausrichtung relativ zur Membranoberfläche könnte dazu beitragen, das Risiko einer versehentlichen Beschädigung der Monoschichten zu verringern.
Die hier beschriebenen Methoden des parazellulären Permeabilitätsassays wurden von einem früheren Protokoll18 übernommen. Änderungen am berichteten Protokoll, die mehrere Probenahmen über 120 Minuten und den Ersatz des beprobten Aliquots durch gleiche Mengen PBS umfassen, werden vorgenommen, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu verbessern. Die Aufrechterhaltung des Gesamtvolumens in der Kammer ist aus mehreren Gründen von entscheidender Bedeutung: Sie bewahrt das osmotische Gleichgewicht, gewährleistet die Zellintegrität, hält den Konzentrationsgradienten aufrecht, der für eine genaue Permeabilitätsbewertung unerlässlich ist, und verhindert Veränderungen des hydrostatischen Drucks, die sich auf die Transportraten auswirken könnten. Diese Praxis, die basolaterale Kammer mit frischem PBS aufzufüllen, das dem Volumen des beprobten fluoreszierenden Tracer-haltigen PBS entspricht, ist entscheidend für die Erhaltung dieser Bedingungen und ermöglicht eine genaue und aussagekräftige Bewertung der Permeabilität der Monolayer. Der parazelluläre Permeabilitätsassay dient als Ergänzung zur TEER-Messung, indem er die Bewegung von Tracermolekülen durch die Monoschicht direkt bewertet. Darüber hinaus führt der Vergleich der TEER-Werte zwischen verschiedenen Laboratorien möglicherweise nicht zu relevanten Erkenntnissen, da diese Werte von zahlreichen Variablen beeinflusst werden können, wie z. B. der Temperatur und den spezifischen Bedingungen, unter denen Zellen kultiviert werden, einschließlich der Zelltypen, der Passagenzahl und der Zusammensetzung des Kulturmediums19. Der parazelluläre Permeabilitätsassay bietet eine funktionelle In-vitro-Bewertung der effektiven Expression von Adhärenen und Tight Junctions innerhalb einer Epithelbarriere20.
Während die Entwicklung von 2D-Monolayern aus 3D-Organoiden einen bedeutenden Fortschritt in der Kulturtechnologie darstellt, ist es wichtig, die mit 2D-Monolayern verbundenen Einschränkungen zu berücksichtigen. Ein großer Nachteil besteht darin, dass es sich um ein statisches Kultursystem handelt, dem die dynamische Stimulation fehlt, die in der In-vivo-Umgebung zu finden ist. Darüber hinaus stellt die Modifikation des Sauerstoffgehalts innerhalb des Kultursystems eine Herausforderung dar, da es offen aufgebaut ist und Kulturplatten mit Deckeln umfasst, wodurch es für eine langfristige Co-Kultur mit anaeroben Bakterien weniger geeignet ist. Diese Einschränkungen könnten möglicherweise durch den Einsatz dynamischerer Kulturplattformen wie mikrofluidische Systeme21 behoben werden, die eine kontrolliertere und physiologisch relevantere Umgebung bieten. Darüber hinaus ist es wichtig zu erkennen, dass die derzeitigen Kulturbedingungen zwar reich an Nährstoffen sind, die für die Aufrechterhaltung des Stammzellwachstums von Vorteil sind, aber möglicherweise nicht optimal sind, um die physiologische Differenzierung der Epithelzellen zu induzieren. Diese Diskrepanz unterstreicht den Optimierungsbedarf in der zukünftigen Forschung, um die in vivo-Bedingungen genau nachzuahmen und den Differenzierungsprozess zu unterstützen. Durch die Beseitigung dieser Einschränkungen und die Verfeinerung dieser Ansätze werden der Nutzen und die Anwendbarkeit von Organoidkulturtechnologien verbessert und kommen der Replikation der komplexen Dynamik und Wechselwirkungen des Magen-Darm-Trakts in vitro näher.
Das Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern aus Rinder-, Ileum- und Rektalgewebe bietet den Forschern ein wertvolles In-vitro-Modell der luminalen Grenzfläche von Dünn- und Dickdarmepithel. Dieses Modell eröffnet enorme Anwendungsmöglichkeiten in grundlegenden Tierernährungsstudien, insbesondere bei der Untersuchung, wie Nährstoffe unter verschiedenen Bedingungen aufgenommen werden. Ein bemerkenswertes Interessengebiet ist die Untersuchung des Leaky-Gut-Syndroms, das durch eine abnormale Erhöhung der gastrointestinalen Permeabilität gekennzeichnet ist, die häufig durch Ernährungsumstellungen und extreme Umgebungstemperaturen ausgelöst wird22,23. Darüber hinaus dient dieses Modell als wesentliches Werkzeug, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen dem Darmmikrobiom und seinem Wirt zu erforschen. Es ermöglicht die Untersuchung, wie kommensale Mikroorganismen die Gesundheit des Wirtsorganismus beeinflussen können, und befasst sich damit mit einem entscheidenden Aspekt der Veterinär- und Medizinwissenschaft 1,24. Darüber hinaus werden durch menschliche Lebensmittel übertragene Krankheitserreger häufig als Kommensale in verschiedenen Segmenten des Rinderdarms gefunden 8,9,25, dieses Protokoll ermöglicht detaillierte Studien der spezifischen Bedingungen, die es diesen Zoonoseerregern ermöglichen, in ihren jeweiligen Nischen zu gedeihen.
In dieser Studie wurde beobachtet, dass rektale und ileale Organoid-abgeleitete Monoschichten unterschiedliche Bedingungen für eine erfolgreiche Entwicklung benötigen. Insbesondere bei der anfänglichen Aussaat von rektalen Organoiden abgeleiteten Monoschichten auf Zellkultureinsätzen, die mit 2% EZM-basiertem Hydrogel in Basalmedien für 1 h hergestellt wurden, wurden große Löcher und Zellablösungen festgestellt. Dieses Problem wurde durch die Umstellung auf ein spezielles rektales Monolayer-Kulturmedium und die Verlängerung der Inkubationszeit auf über Nacht vor der Aussaat gelöst, während von ilealen Organoiden abgeleitete Monolayer erfolgreich mit einem kürzeren Vorbereitungsprotokoll entwickelt wurden. Darüber hinaus verbesserte die Zugabe von CHIR99021 zum Kulturmedium die Etablierung rektaler Monoschichten26 konsistent, war aber für ileale Monoschichten27 nicht erforderlich. Darüber hinaus erforderten ileale Monoschichten im Vergleich zu rektalen Organoiden eine höhere Zelldichte für eine erfolgreiche Entwicklung27. Diese optimierten Bedingungen (Tabelle 1) haben wiederholt Monolayer entwickelt, die eine widerstandsfähige Barriereintegrität aufrechterhalten, was unterstreicht, wie wichtig es ist, die Kulturbedingungen auf das spezifische Darmsegment zuzuschneiden.
Der Zugang zu einem Modell, das die Komplexität der multizellulären Abstammung des in vivo-Darms genau widerspiegelt, ist für diese Untersuchungen von entscheidender Bedeutung. Es ermöglicht Forschern, die natürlichen Bedingungen der Darmumgebung genau nachzuahmen und bietet so eine zuverlässigere Grundlage für Experimente. Mit diesem Protokoll erhalten die Forscher ein robustes Modell, das ihre Forschungsfähigkeiten verbessert und möglicherweise zu bahnbrechenden Entdeckungen in ihren Forschungsgebieten führt. Dieser Ansatz trägt nicht nur zum Verständnis der Darmgesundheit und -krankheit bei, sondern hilft auch bei der Entwicklung von Strategien zur Verbesserung der Viehhaltung und der Lebensmittelsicherheit.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde teilweise vom Office of the Director National Institutes of Health (K01OD030515 and R21OD031903 to YMA) und dem WSU VCS Resident and Graduate Student Research Grant (to GDD) unterstützt. Die Autoren danken dem teilnehmenden Schlachthof für die Bereitstellung von Spenderrindern.
Materials
| Basal Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 (1X) | Gibco | 12634-010 | n/a |
| GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | 2 mM |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
| Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | 1X |
| Organoid Culture Medium (Supplements to Basal Medium) | |||
| A-83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788-5MG | 500 nM |
| B27 Supplement (50X) | Gibco | 17504-001 | 1X |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | 50 ng/mL |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | MP Biomedicals | 194603 | 1 mM |
| N-2 MAX Media Supplement (100X) | R&D Systems | AR009 | 1X |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin Conditioned Medium | n/a | n/a | 10 vol/vol % |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | 100 µg/mL |
| R-Spondin-1 Conditioned Medium | n/a | n/a | 20 vol/vol % |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
| Monolayer Culture Medium (Supplements to Organoid Culture Medium) | |||
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046-5MG | 2.5 µM |
| HI FBS | Gibco | 10438-034 | 20 vol/vol % |
| LY2157299 | Sigma-Aldrich | SML2851-5MG | 500 nM |
| Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin | BD Biosciences | 560061 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | 1:400 dilution |
| BSA | Cytiva | SH30574.02 | 2 w/vol % |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | n/a |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 dilution |
| DPBS (1X) | Gibco | 14190-144 | n/a |
| Fluorescein Isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | FD4-100MG | 0.5 mg/mL |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | n/a |
| Paraformaldehyde Solution (4%) | Thermo Scientific | J19943K2 | n/a |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | n/a |
| SNA, EBL, Fluorescein | Vector Laboratories | FL-1301 | 1:100 dilution |
| Triton X-100 | Thermo Scientific | A16046.AE | 0.3 vol/vol % |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | n/a |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | VWR Life Science | K940-100ML | n/a |
| Materials and Equipment | |||
| 0.4 µm Cell Culture Insert | Falcon | 353095 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | |
| 48-well Cell Culture Plate | Thermo Scientific | 150687 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 655086 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5910Ri | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 370 | |
| Epithelial Volt-Ohm Meter | Millipore | Millicell ERS-2 | |
| Hemocytometer | LW Scientific | CTL-HEMM-GLDR | |
| Inverted Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP8-X | |
| Inverted Phase-Contrast Microscope | Leica Microsystems | DMi1 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-540-B | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpecrtraMax i3x | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Scalpel Blade | iMed Scientific | – | #11 carbon steel |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Software | |||
| LAS X imaging software | Leica Microsystems | LAS X 3.7.6.25997 | |
| Microplate Reader software | Molecular Devces | SoftMax Pro 7.1.2 |
Referenzen
- Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
- Fitzgerald, S. F., et al. Shiga toxin sub-type 2a increases the efficiency of Escherichia coli O157 transmission between animals and restricts epithelial regeneration in bovine enteroids. PLoS Pathogens. 15 (10), e1008003 (2019).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trend Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
- Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33 (2021).
- Kawasaki, M., Dykstra, G. D., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Adult bovine-derived small and large intestinal organoids: In vitro development and maintenance. J Tissue Eng Regene Med. 2023, e3095002 (2023).
- Kvidera, S. K., et al. Intentionally induced intestinal barrier dysfunction causes inflammation, affects metabolism, and reduces productivity in lactating Holstein cows. J Dairy Sci. 100 (5), 4113-4127 (2017).
- Crawford, C. K., et al. Inflammatory cytokines directly disrupt the bovine intestinal epithelial barrier. Sci Rep. 12 (1), 14578 (2022).
- Heredia, N., García, S. Animals as sources of food-borne pathogens: A review. Animal Nutri. 4 (3), 250-255 (2018).
- Naylor, S. W., et al. Lymphoid follicle-dense mucosa at the terminal rectum is the principal site of colonization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in the bovine host. Infect Immun. 71 (3), 1505-1512 (2003).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520.e4 (2019).
- Pullinger, G. D., et al. Systemic translocation of Salmonella enterica Serovar Dublin in cattle occurs predominantly via efferent lymphatics in a cell-free niche and requires type III secretion system 1 (T3SS-1) but not T3SS-2. Infect Immun. 75 (11), 5191-5199 (2007).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), e0000321 (2021).
- Varani, J., McClintock, S. D., Aslam, M. N. Cell-matrix interactions contribute to barrier function in human colon organoids. Front Med. 9, 838975 (2022).
- Freire, R., et al. Human gut derived-organoids provide model to study gluten response and effects of microbiota-derived molecules in celiac disease. Sci Rep. 9, 7029 (2019).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), e0231423 (2020).
- Kogut, M. H., Arsenault, R. J. Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production. Front Vet Sci. 3, 71 (2016).
- Lingard, E., et al. Optimising a self-assembling peptide hydrogel as a Matrigel alternative for 3-dimensional mammary epithelial cell culture. Biomater Adv. 160, 213847 (2024).
- Turksen, K. . Permeability Barrier: Methods and Protocols. , (2011).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in Transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (4), 659 (2018).
- Sanz-Fernandez, M. V., et al. Targeting the hindgut to improve health and performance in cattle. Animals. 10 (10), 1817 (2020).
- Gressley, T. F., Hall, M. B., Armentano, L. E. Ruminant nutrition symposium: Productivity, digestion, and health responses to hindgut acidosis in ruminants. J Anim Sci. 89 (4), 1120-1130 (2011).
- O’Hara, E., Neves, A. L. A., Song, Y., Guan, L. L. The role of the gut microbiome in cattle production and health: Driver or passenger. Ann Rev Animal Biosci. 8 (2020), 199-220 (2020).
- Beach, J. C., Murano, E. A., Acuff, G. R. Prevalence of Salmonella and Campylobacter in beef cattle from transport to slaughter. J Food Protect. 65 (11), 1687-1693 (2002).
- Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Accessible luminal interface of bovine rectal organoids generated from cryopreserved biopsy tissues. PLoS One. 19 (3), e0301079 (2024).
- Kawasaki, M., McConnel, C. S., Burbick, C. R., Ambrosini, Y. M. Pathogen-epithelium interactions and inflammatory responses in Salmonella Dublin infections using ileal monolayer models derived from adult bovine organoids. Scientific Reports. 14 (1), 11479 (2024).
