Summary

Embryotransfer-Operation mittels Laparotomie bei Jungsauen

Published: October 18, 2024
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der chirurgischen Technik, die beim Transfer von geklonten Schweineembryonen mittels Laparotomie bei Jungsauen verwendet wird.

Abstract

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die chirurgische Technik für den Transfer geklonter Schweineembryonen in den Eileiter zu demonstrieren, eine Methode, die bei der Herstellung von genetisch veränderten Schweinen für die biomedizinische Forschung weit verbreitet ist. Neun Jungsauen wurden einer hormonellen Synchronisation und Laparotomie unterzogen, um geklonte Embryonen, die durch somatischen Zellkerntransfer (SCNT) in Stadien von bis zu 4 Zellen am Tag 2 erzeugt wurden, in den Eileiter zu übertragen. Die Schwangerschaftsdiagnose wurde 30 Tage nach der Transferoperation durch Ultraschalluntersuchung durchgeführt. Sechs der neun operierten Jungsauen zeigten bei der Ultraschalluntersuchung Anzeichen einer Trächtigkeit. Da es jedoch keine Fortschritte in der Entwicklung des Fötus gab, die durch eine Ultraschalluntersuchung beurteilt wurden, wurden die Jungsauen nach 60 Tagen einer Autopsie unterzogen, um biologisches Material zu sammeln und das Fortpflanzungssystem zu beurteilen. Adhäsionen wurden in den Gebärmutterhörnern, Eierstöcken und Eileitern beobachtet. Aus dem Uteruslumen von zwei der euthanasierten Jungsauen wurden eine und vier embryonale Strukturen mit einem Gestationsalter zwischen 12 und 20 Tagen gewonnen. Trotz des Fehlens lebender Ferkel, was wahrscheinlich auf die geringe Effizienz des Transfers von geklonten Schweineembryonen zurückzuführen ist, die von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Anzahl und Qualität der übertragenen Embryonen, beeinflusst wird, erwies sich die vorgestellte Operationstechnik als schnell und sicher.

Introduction

Schweine sind aufgrund ihrer anatomischen, physiologischen und genetischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen ein hervorragendes experimentelles Modell für die biomedizinische Forschung1. Diese Tiere wurden häufig in der Forschung im Zusammenhang mit der Xenotransplantation eingesetzt, mit der Absicht, Organe, Zellen oder Gewebe zu produzieren, die bei der Transplantation in den Menschen ein geringes Abstoßungsrisiko aufweisen. Die Xenotransplantationsforschung zielt darauf ab, die Organversorgung für die Transplantation beim Menschen zu erhöhen und so die Warteliste der Patienten zu verkürzen2.

Die Produktion von Schweinen für die Xenotransplantation umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Herstellung von Klonen aus genetisch veränderten Schweinezellen. Nach der In-vitro-Produktion von genetisch veränderten geklonten Embryonen werden die Embryonen mit einem synchronisierten Östruszyklus in das Fortpflanzungssystem einer Sau übertragen, um die Uterusphysiologie für die Aufnahme und Trächtigkeit des neuen conceptus3 vorzubereiten.

Der Embryotransfer bei Schweinen kann mit nicht-invasiven oder invasiven Methoden durchgeführt werden4. Zu den nicht-invasiven Methoden gehört der transzervikale Transfer, der keinen chirurgischen Eingriff erfordert. Diese Methode ist jedoch auf den Transfer von Embryonen in späteren Entwicklungsstadien (d. h. Morula- oder Blastozystenstadien) beschränkt und ermöglicht keine genaue Bestimmung der Kathetereinführungsstelle oder der Embryoablagerung5. Laparoskopie und Laparotomie gelten als invasive Methoden des Embryotransfers. Die Laparoskopie ist weniger invasiv, erfordert aber eine spezielle und kostspielige Ausrüstung, und ihre Effizienz variiert erheblich (von weniger als 20 % bis über 80 %), was auf verschiedene Faktoren zurückzuführen ist, wie z. B. die Schwierigkeit bei der Manipulation der Fortpflanzungsstrukturen und die Art des verwendeten Katheters 4,6. Daher ist der Transfer über die Laparoskopie im Vergleich zu chirurgischen Transfermethoden über die Laparotomieimmer noch weniger effizient.

Der Embryotransfer bei Sauen mittels Laparotomie ist ein relativ einfacher und schneller Eingriff, der in der Regel etwa 30 Minuten dauert. Sie sollte jedoch in einem chirurgischen Zentrum durchgeführt werden, das mit einem Inhalationsanästhesiegerät und einem spezialisierten Team ausgestattet ist. Für kommerzielle Schweinestämme (wie z.B. Landrassen, Große Weiße oder deren Kreuzungen) sind aufgrund des hohen Gewichts der Tiere (ca. 130-150 kg) spezielle Geräte wie Hebezeuge zum Heben von Jungsauen und ein breiter, stabiler Operationstisch erforderlich.

Damit die Operation erfolgreich ist, müssen die Embryonen zuvor auf ihr Entwicklungsstadium hin untersucht werden. Es wird empfohlen, Embryonen von bis zu 4 Zellen in die Gebärmutterröhre zu übertragen. Embryonen in Stadien jenseits von 4 Zellen, wie Morulas und Blastozysten, sollten auf das Gebärmutterhorn übertragen werden 7,8.

Obwohl Forschungsgruppen weltweit die Produktion und den chirurgischen Transfer von genetisch veränderten geklonten Schweineembryonen durchführen, gibt es immer noch keine klar definierten Protokolle, die dieses Verfahren durch Videos demonstrieren. Dieser Ansatz ist entscheidend für den Erfolg der Schwangerschaft, da die Technik eine genaue Ablagerung der Embryonen an der genauen Stelle des Eileiters erfordert, was die Lokalisierung des Eileiterostiums und das Einführen der Pipette mit den Embryonen umfasst. Diese Technik kann durch Erklärungsvideos des gesamten Verfahrens besser verstanden werden. Daher zielt dieser Artikel darauf ab, die Laparotomie-Operation für den Transfer geklonter Embryonen in den Eileiter von Jungsauen zu demonstrieren, eine wesentliche Voraussetzung für die zukünftige Produktion von gentechnisch veränderten Schweinen, die für Xenotransplantationen oder andere verwandte Zwecke verwendet werden sollen.

Protocol

Diese Studie wurde von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in der Forschung des Instituts für Veterinärmedizin und Tierwissenschaften der Universität von São Paulo, Protokollnummer 6088030523, genehmigt. Neun sieben Monate alte Jungsauen aus der Kernschweinezucht Água Branca in der Stadt Itu im brasilianischen Bundesstaat São Paulo wurden direkt nach dem zweiten Brunstnachweis verwendet9. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studi…

Representative Results

In diesem Artikel soll die Laparotomie-Operation für den Transfer geklonter Embryonen in den Eileiter von Jungsauen demonstriert werden. Alle Tiere blieben in einer adäquaten Anästhesieebene, ohne dass es zu intraoperativen Zwischenfällen oder Komplikationen während der Narkoseerholung kam. Die Jungsauen brauchten im Durchschnitt 2-3 Stunden, um nach Beendigung der Operation wieder aufzustehen. Alle chirurgischen Eingriffe dauerten im Durchschnitt 44 Minu…

Discussion

Die beschriebene chirurgische Methode wurde zuvor von anderen Forschungsgruppen durchgeführt, die sich mit der Produktion von geklonten Schweinen oder genetisch veränderten geklonten Schweinen beschäftigen, mit Berichten über Geburten nach der Implementierung dieser Technik 15,16,17,18,19,20.</…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bedanken uns bei der Tierklinik für Pferde und der Tierklinik für Wiederkäuer der Fakultät für Veterinärmedizin der Universität São Paulo (FMVZ/USP), São Paulo, Brasilien, FAPESP (Stipendium 2022/11459-3, Forschungsstiftung São Paulo), EMS Pharma, CNPq (Stipendium 405254/2022-9) und Água Branca Pig Farming, Itu, São Paulo, Brasilien.

Materials

0.25 mL straw generic Surgical material
1 mL syringe Descarpack 341001 Surgical material
10 mL syringe Descarpack 324601 Surgical material
20 mL syringe Descarpack 324801 Surgical material
3 mL syringe Descarpack 324201 Surgical material
5 mL syringe Descarpack 324401 Surgical material
60 mL syringe Descarpack 323201 Surgical material
9 mm endotracheal tube Rusch 112482-000090 Surgical material
Allis forceps generic Surgical instrument
Amox LA JA Saúde Animal MAPA registration: 8.781/2004 Pharmaceutical drug
Bakhaus forceps generic Surgical instrument
Catheter 20G Descarpack 362401 Catheter for intravenous access
Cetamin Agener União MAPA registration: SP-000292-5.000011  Anesthetic
Conductive clinical gel RMC ANVISA registration: 80122200013 Surgical material
Dipyrone D-500 Zoetis MAPA registration: SP0000728-46 Pharmaceutical drug
Disposable scalpel n. 22 Wiltex ANVISA registration: 10150470565 Surgical instrument
Disposable sterile sponge-brush Rioquimica 7.89778E+12 Surgical asepsis
Easy-Scan:Go IMV ESCG01 Ultrasound
Endozime AW Plus Ruhof 34514 Detergent for surgical instruments
Fentanil (Fentanest) Cristália ANVISA registration: 1029800810159 Anesthetic
Gosset retractor generic Surgical instrument
Halstead-mosquito hemostatic forceps generic Surgical instrument
Healing ointment – Unguento Pearson Pearson SA MAPA registration: SP0000094-16 Pharmaceutical drug
hydrogen peroxide solution Rioquimica ANVISA registration: 218690015 Surgical material
Isofluorane Biochimico ANVISA registration: 100630222 Anesthetic
IV Drip set extensor generic Fluid therapy
IV Macro drip set Descarpack 410301 Fluid therapy
Lactofur (ceftiofur) Ourofino SA MAPA registration: SP0000051-50 Pharmaceutical drug
Laringoscope Surgical instrument
Maxicam 2% Ourofino SA MAPA registration: SP0000051-69 Pharmaceutical drug
Micropore adhesive 5 cm x 10 cm  generic 1530 Surgical material
Midazolam Hipolabor ANVISA registration: 1134301430035 Anesthetic
Multi-Way IV Infusion Set Descarpack 413201 Fluid therapy
Needle 40 mm x 1.2 mm Descarpack 353601 Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle 40 mm x 1.6 mm Wiltex ANVISA registration: 10150470664 Sterile needle for applying medicines and anesthetics.
Needle holder generic Surgical instrument
Nylon 2 suture trhead Shalon Medical N502CTI40 Surgical material
Ordinary pen generic Regular pen for taking notes
Physiological solution 0.9% 500 mL bag JP Farma MS:1.0491.0070 Fluid therapy
Polyglycolic acid 2 suture thread Atramat G4099-75H Surgical material
Potassium chloride Samtec ANVISA registration: 1559200010139 Parenteral drug
Procedure gloves Descarpack 122401 Personal Protective Equipment (PPE)
Propofol (Provive) União Química ANVISA registration: 1049714490057 Anesthetic
Ringer lactate solution 500 mL bag JP Farma MS:1.0491.0061 Fluid therapy
Riohex 0.5% clorexidine alcohol solution Rioquimica 218690356 Surgical asepsis
Riohex 2% clorexidine solution with surfactant Rioquimica 218690356 Surgical asepsis
Scalp 21 G Descarpack 421201 Surgical material
Shoe covers generic Personal Protective Equipment (PPE)
Sterile compresses Cremer ANVISA registration: 10071150065 Surgical material
Sterile gauze pad Procitex ANVISA registration: 80245210083 Surgical material
Sterile surgical drapes 140 cm x 90 cm  Venkuri 7010003 Surgical material
Sterile surgical drapes 150 cm x 190 cm  PolarFix F00208 Surgical material
Sterile surgical gloves Mucambo CA: 39.317 Personal Protective Equipment (PPE)
Stethoscope generic Surgical equipment
Surgical cap Descarpack 93201 Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical gown Descarpack 231101 Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical mask Descarpack 110701 Personal Protective Equipment (PPE)
Surgical scissors blunt-blunt generic Surgical instrument
Surgical scissors sharp-sharp generic Surgical instrument
Surgical stapler Tradevet Surgical material
Tekbond super glue Tek Bond 78072720030 Surgical material
Thermometer generic Surgical equipment
Three Way Stopcock Solidor 374 Surgical material
Tramadol hydrocloride Agener União MAPA registration: SP-000292-5.000002 Anesthetic
Transparent film dressing Skinupper ANVISA registration: 82307460014 Surgical material
Waterproof adhesive 10 cm x 4.5 cm  generic 364828 Surgical material

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Araujo, M. S., Pegoraro Poor, A., Vieira Chida, V., Torres, G., Leme, L., Santos, N. d. S. B., Suzuki, Â. M., Yoshinaga, T. T., Tolezano, G. C., Costa, A., Ribeiro, E. L., Bicalho, T. d. S., Barbosa, D., de O. Braga, K. A., Brito, L. A., Júnior, L. C. d. C., Zatz, M., Raia, S. M. A., Goulart, E. Embryo Transfer Surgery via Laparotomy in Gilts. J. Vis. Exp. (212), e66984, doi:10.3791/66984 (2024).

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