Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der chirurgischen Technik, die beim Transfer von geklonten Schweineembryonen mittels Laparotomie bei Jungsauen verwendet wird.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, die chirurgische Technik für den Transfer geklonter Schweineembryonen in den Eileiter zu demonstrieren, eine Methode, die bei der Herstellung von genetisch veränderten Schweinen für die biomedizinische Forschung weit verbreitet ist. Neun Jungsauen wurden einer hormonellen Synchronisation und Laparotomie unterzogen, um geklonte Embryonen, die durch somatischen Zellkerntransfer (SCNT) in Stadien von bis zu 4 Zellen am Tag 2 erzeugt wurden, in den Eileiter zu übertragen. Die Schwangerschaftsdiagnose wurde 30 Tage nach der Transferoperation durch Ultraschalluntersuchung durchgeführt. Sechs der neun operierten Jungsauen zeigten bei der Ultraschalluntersuchung Anzeichen einer Trächtigkeit. Da es jedoch keine Fortschritte in der Entwicklung des Fötus gab, die durch eine Ultraschalluntersuchung beurteilt wurden, wurden die Jungsauen nach 60 Tagen einer Autopsie unterzogen, um biologisches Material zu sammeln und das Fortpflanzungssystem zu beurteilen. Adhäsionen wurden in den Gebärmutterhörnern, Eierstöcken und Eileitern beobachtet. Aus dem Uteruslumen von zwei der euthanasierten Jungsauen wurden eine und vier embryonale Strukturen mit einem Gestationsalter zwischen 12 und 20 Tagen gewonnen. Trotz des Fehlens lebender Ferkel, was wahrscheinlich auf die geringe Effizienz des Transfers von geklonten Schweineembryonen zurückzuführen ist, die von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Anzahl und Qualität der übertragenen Embryonen, beeinflusst wird, erwies sich die vorgestellte Operationstechnik als schnell und sicher.
Schweine sind aufgrund ihrer anatomischen, physiologischen und genetischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen ein hervorragendes experimentelles Modell für die biomedizinische Forschung1. Diese Tiere wurden häufig in der Forschung im Zusammenhang mit der Xenotransplantation eingesetzt, mit der Absicht, Organe, Zellen oder Gewebe zu produzieren, die bei der Transplantation in den Menschen ein geringes Abstoßungsrisiko aufweisen. Die Xenotransplantationsforschung zielt darauf ab, die Organversorgung für die Transplantation beim Menschen zu erhöhen und so die Warteliste der Patienten zu verkürzen2.
Die Produktion von Schweinen für die Xenotransplantation umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Herstellung von Klonen aus genetisch veränderten Schweinezellen. Nach der In-vitro-Produktion von genetisch veränderten geklonten Embryonen werden die Embryonen mit einem synchronisierten Östruszyklus in das Fortpflanzungssystem einer Sau übertragen, um die Uterusphysiologie für die Aufnahme und Trächtigkeit des neuen conceptus3 vorzubereiten.
Der Embryotransfer bei Schweinen kann mit nicht-invasiven oder invasiven Methoden durchgeführt werden4. Zu den nicht-invasiven Methoden gehört der transzervikale Transfer, der keinen chirurgischen Eingriff erfordert. Diese Methode ist jedoch auf den Transfer von Embryonen in späteren Entwicklungsstadien (d. h. Morula- oder Blastozystenstadien) beschränkt und ermöglicht keine genaue Bestimmung der Kathetereinführungsstelle oder der Embryoablagerung5. Laparoskopie und Laparotomie gelten als invasive Methoden des Embryotransfers. Die Laparoskopie ist weniger invasiv, erfordert aber eine spezielle und kostspielige Ausrüstung, und ihre Effizienz variiert erheblich (von weniger als 20 % bis über 80 %), was auf verschiedene Faktoren zurückzuführen ist, wie z. B. die Schwierigkeit bei der Manipulation der Fortpflanzungsstrukturen und die Art des verwendeten Katheters 4,6. Daher ist der Transfer über die Laparoskopie im Vergleich zu chirurgischen Transfermethoden über die Laparotomieimmer noch weniger effizient.
Der Embryotransfer bei Sauen mittels Laparotomie ist ein relativ einfacher und schneller Eingriff, der in der Regel etwa 30 Minuten dauert. Sie sollte jedoch in einem chirurgischen Zentrum durchgeführt werden, das mit einem Inhalationsanästhesiegerät und einem spezialisierten Team ausgestattet ist. Für kommerzielle Schweinestämme (wie z.B. Landrassen, Große Weiße oder deren Kreuzungen) sind aufgrund des hohen Gewichts der Tiere (ca. 130-150 kg) spezielle Geräte wie Hebezeuge zum Heben von Jungsauen und ein breiter, stabiler Operationstisch erforderlich.
Damit die Operation erfolgreich ist, müssen die Embryonen zuvor auf ihr Entwicklungsstadium hin untersucht werden. Es wird empfohlen, Embryonen von bis zu 4 Zellen in die Gebärmutterröhre zu übertragen. Embryonen in Stadien jenseits von 4 Zellen, wie Morulas und Blastozysten, sollten auf das Gebärmutterhorn übertragen werden 7,8.
Obwohl Forschungsgruppen weltweit die Produktion und den chirurgischen Transfer von genetisch veränderten geklonten Schweineembryonen durchführen, gibt es immer noch keine klar definierten Protokolle, die dieses Verfahren durch Videos demonstrieren. Dieser Ansatz ist entscheidend für den Erfolg der Schwangerschaft, da die Technik eine genaue Ablagerung der Embryonen an der genauen Stelle des Eileiters erfordert, was die Lokalisierung des Eileiterostiums und das Einführen der Pipette mit den Embryonen umfasst. Diese Technik kann durch Erklärungsvideos des gesamten Verfahrens besser verstanden werden. Daher zielt dieser Artikel darauf ab, die Laparotomie-Operation für den Transfer geklonter Embryonen in den Eileiter von Jungsauen zu demonstrieren, eine wesentliche Voraussetzung für die zukünftige Produktion von gentechnisch veränderten Schweinen, die für Xenotransplantationen oder andere verwandte Zwecke verwendet werden sollen.
Die beschriebene chirurgische Methode wurde zuvor von anderen Forschungsgruppen durchgeführt, die sich mit der Produktion von geklonten Schweinen oder genetisch veränderten geklonten Schweinen beschäftigen, mit Berichten über Geburten nach der Implementierung dieser Technik 15,16,17,18,19,20.</…
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei der Tierklinik für Pferde und der Tierklinik für Wiederkäuer der Fakultät für Veterinärmedizin der Universität São Paulo (FMVZ/USP), São Paulo, Brasilien, FAPESP (Stipendium 2022/11459-3, Forschungsstiftung São Paulo), EMS Pharma, CNPq (Stipendium 405254/2022-9) und Água Branca Pig Farming, Itu, São Paulo, Brasilien.
0.25 mL straw | generic | – | Surgical material |
1 mL syringe | Descarpack | 341001 | Surgical material |
10 mL syringe | Descarpack | 324601 | Surgical material |
20 mL syringe | Descarpack | 324801 | Surgical material |
3 mL syringe | Descarpack | 324201 | Surgical material |
5 mL syringe | Descarpack | 324401 | Surgical material |
60 mL syringe | Descarpack | 323201 | Surgical material |
9 mm endotracheal tube | Rusch | 112482-000090 | Surgical material |
Allis forceps | generic | – | Surgical instrument |
Amox LA | JA Saúde Animal | MAPA registration: 8.781/2004 | Pharmaceutical drug |
Bakhaus forceps | generic | – | Surgical instrument |
Catheter 20G | Descarpack | 362401 | Catheter for intravenous access |
Cetamin | Agener União | MAPA registration: SP-000292-5.000011 | Anesthetic |
Conductive clinical gel | RMC | ANVISA registration: 80122200013 | Surgical material |
Dipyrone D-500 | Zoetis | MAPA registration: SP0000728-46 | Pharmaceutical drug |
Disposable scalpel n. 22 | Wiltex | ANVISA registration: 10150470565 | Surgical instrument |
Disposable sterile sponge-brush | Rioquimica | 7.89778E+12 | Surgical asepsis |
Easy-Scan:Go | IMV | ESCG01 | Ultrasound |
Endozime AW Plus | Ruhof | 34514 | Detergent for surgical instruments |
Fentanil (Fentanest) | Cristália | ANVISA registration: 1029800810159 | Anesthetic |
Gosset retractor | generic | – | Surgical instrument |
Halstead-mosquito hemostatic forceps | generic | – | Surgical instrument |
Healing ointment – Unguento Pearson | Pearson SA | MAPA registration: SP0000094-16 | Pharmaceutical drug |
hydrogen peroxide solution | Rioquimica | ANVISA registration: 218690015 | Surgical material |
Isofluorane | Biochimico | ANVISA registration: 100630222 | Anesthetic |
IV Drip set extensor | generic | – | Fluid therapy |
IV Macro drip set | Descarpack | 410301 | Fluid therapy |
Lactofur (ceftiofur) | Ourofino SA | MAPA registration: SP0000051-50 | Pharmaceutical drug |
Laringoscope | – | – | Surgical instrument |
Maxicam 2% | Ourofino SA | MAPA registration: SP0000051-69 | Pharmaceutical drug |
Micropore adhesive 5 cm x 10 cm | generic | 1530 | Surgical material |
Midazolam | Hipolabor | ANVISA registration: 1134301430035 | Anesthetic |
Multi-Way IV Infusion Set | Descarpack | 413201 | Fluid therapy |
Needle 40 mm x 1.2 mm | Descarpack | 353601 | Sterile needle for applying medicines and anesthetics. |
Needle 40 mm x 1.6 mm | Wiltex | ANVISA registration: 10150470664 | Sterile needle for applying medicines and anesthetics. |
Needle holder | generic | – | Surgical instrument |
Nylon 2 suture trhead | Shalon Medical | N502CTI40 | Surgical material |
Ordinary pen | generic | – | Regular pen for taking notes |
Physiological solution 0.9% 500 mL bag | JP Farma | MS:1.0491.0070 | Fluid therapy |
Polyglycolic acid 2 suture thread | Atramat | G4099-75H | Surgical material |
Potassium chloride | Samtec | ANVISA registration: 1559200010139 | Parenteral drug |
Procedure gloves | Descarpack | 122401 | Personal Protective Equipment (PPE) |
Propofol (Provive) | União Química | ANVISA registration: 1049714490057 | Anesthetic |
Ringer lactate solution 500 mL bag | JP Farma | MS:1.0491.0061 | Fluid therapy |
Riohex 0.5% clorexidine alcohol solution | Rioquimica | 218690356 | Surgical asepsis |
Riohex 2% clorexidine solution with surfactant | Rioquimica | 218690356 | Surgical asepsis |
Scalp 21 G | Descarpack | 421201 | Surgical material |
Shoe covers | generic | – | Personal Protective Equipment (PPE) |
Sterile compresses | Cremer | ANVISA registration: 10071150065 | Surgical material |
Sterile gauze pad | Procitex | ANVISA registration: 80245210083 | Surgical material |
Sterile surgical drapes 140 cm x 90 cm | Venkuri | 7010003 | Surgical material |
Sterile surgical drapes 150 cm x 190 cm | PolarFix | F00208 | Surgical material |
Sterile surgical gloves | Mucambo | CA: 39.317 | Personal Protective Equipment (PPE) |
Stethoscope | generic | – | Surgical equipment |
Surgical cap | Descarpack | 93201 | Personal Protective Equipment (PPE) |
Surgical gown | Descarpack | 231101 | Personal Protective Equipment (PPE) |
Surgical mask | Descarpack | 110701 | Personal Protective Equipment (PPE) |
Surgical scissors blunt-blunt | generic | – | Surgical instrument |
Surgical scissors sharp-sharp | generic | – | Surgical instrument |
Surgical stapler | Tradevet | – | Surgical material |
Tekbond super glue | Tek Bond | 78072720030 | Surgical material |
Thermometer | generic | – | Surgical equipment |
Three Way Stopcock | Solidor | 374 | Surgical material |
Tramadol hydrocloride | Agener União | MAPA registration: SP-000292-5.000002 | Anesthetic |
Transparent film dressing | Skinupper | ANVISA registration: 82307460014 | Surgical material |
Waterproof adhesive 10 cm x 4.5 cm | generic | 364828 | Surgical material |