Floresan In Situ Hibridizasyon ile Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Numunelerde Gen Amplifikasyonunun Sağlam Tespiti

Bu araştırma protokolü, Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. Ameliyat öncesi tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. 1. Reaktifler ve malzemelerin hazırlanması 0.2 N sodyum klorür (HCl) çözeltisini, 8.212 mL HCl (% 37 w / w veya 12.1 N) 491.788 mL ddH2O’ya yavaşça ekleyerek bir davlumbazda hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.DİKKAT: Suya yavaş yavaş asit ekleyin. Aside su eklemeyin. 1.47 g Tri-sodyum sitrat (dihidrat) 400 mL ddH2O içinde çözerek 10 mM sitrik asit çözeltisi (pH 6.0) hazırlayın. pH 6.0’a ayarlamak için HCl kullanın ve ardından son hacmi ddH2O ile 500 mL’ye getirin. Tamponu RT’de saklayın. 100 μL Tween-20 ila 900 μL ddH2O ekleyerek Tween-20 çözeltisini hazırlayın. RT’de saklayın. 45 mL ddH2O’ya 5 mL IGEPAL CA-630 ekleyerek% 10 IGEPAL çözeltisini hazırlayın. 44.1 g Tri-sodyum sitrat (dihidrat) ve 87.65 g sodyum klorür (NaCl) 900 mL ddH2O içinde çözerek 20x SSC (pH 7.0, 3 M NaCl, 0.3 M Sodyum Sitrat) çözeltisini hazırlayın. pH 7.0’a ayarlamak için HCl kullanın ve ardından son hacmi ddH2O ile 1000 mL’ye getirin. Tamponu RT’de saklayın. 900 mL ddH2O’ya 100 mL 20x SSC ekleyerek 2x SSC çözeltisini hazırlayın. Gerekirse, 0,5 mL koruyucu ekleyin (Malzeme Tablosu). RT’de saklayın. 910 μL ddH2O, 500 μL 20x SSC, 50 μL Tween-20, 40 μL RNase A, 1 mL dekstran sülfat ve 2.5 mL formamid karıştırarak prob hibridizasyon tamponunu hazırlayın. 1 mL’ye ayırın ve -20 °C’de saklayın. 100 mL 2x SSC, 15 mL IGEPAL ve 385 mL ddH2O karıştırarak 0.4x SSC’yi %0.3 IGEPAL çözeltisi ile hazırlayın. 495 mL 2x SSC çözeltisine 5 mL IGEPAL ekleyerek 2x SSC’yi %0.1 IGEPAL çözeltisi ile hazırlayın. RT’de saklayın. Kullanmadan önce 99 μL Tris-EDTA tamponuna 1 μL Proteinaz K ekleyerek Proteinaz K sindirim tamponunu taze olarak hazırlayın. 1 mg DAPI’yi 1 mL ddH2O’da çözerek 1 mg / mL DAPI depolama stoğu hazırlayın. -20 ° C’de ve ışıktan uzakta saklayın. 999 μL 2x SSC çözeltisine 1 μL DAPI depolama stoğu ekleyerek DAPI çalışma çözümünü hazırlayın. Kullanana kadar ışıktan uzak tutunuz. 2. Numune ön işlemi NOT: Burada kullanılan slayt numuneyi içermektedir. Slaytı 60-90°C’de 20 dakika veya gece boyunca yaşlandırın (Şekil 1).NOT: Bu adım parafin erimesini kolaylaştırır. Genellikle 20 dakikalık ısıtma yeterlidir. Programa uyum sağlamak için bir geceye kadar uzatılabilir. Slaytı 10 dakika boyunca bir Coplin kavanozunda ksilen veya ikamelerine batırarak deparafinize edin. Bu adımı taze ksilen veya ikameleriyle tekrarlayın. Aşağıdaki tüm ön işlem ve yıkama adımlarını bir Coplin kavanozunda gerçekleştirin.NOT: Ksilen ikameleri, ksilene güvenli ve çevre dostu alternatiflerdir. İkamelerden biri (Malzeme Tablosuna bakınız), daha iyi olmasa da, ksilen kadar iyi performans gösterir. Ksilen ikameleri ksilenden daha az koku üretse de, çeker ocak içinde kullanılması tavsiye edilir. Ksilen ikamelerine erişilemiyorsa, tüm prosedürler herhangi bir değişiklik yapılmadan ksilen bazlı deparafinizasyon ile uyumludur. Ksilen ikamesini 0 etanol ile 5 dakika yıkayın. Slaytı 5 dakika boyunca etanol daldırma ile yeniden sulandırın. Slaytı 20 dakika boyunca RT’de 0,2 N hidroklorik aside (HCl) daldırın.NOT: HCl, FISH problarına11 DNA erişilebilirliğini iyileştirmek için bazik nükleer proteinler gibi asitte çözünen proteinleri etkili bir şekilde çıkarır. Slaytı 10 mM sıcak sitrik asit çözeltisine daldırın ve 90-95 ° C’de 20 dakika inkübe edin.NOT: Yüksek sıcaklıklarda sitrik asit muamelesi benzer şekilde asitte çözünür proteinleri çıkarır. Her iki asit tedavisinin de otofloresan12’yi azaltmak için hücre dışı matris proteinlerini çıkardığı düşünülmektedir. Sitrik çözeltinin lam üzerine uygulanmadan önce istenen sıcaklık aralığına önceden ısıtılması tavsiye edilir. Mikrodalga bunu yapmak için uygun bir yol olabilir. Sous vide pişirici gibi bir su banyosu, yüksek sıcaklıkta inkübasyon için en etkili ve ekonomik çözümdür. PH’ı nötralize etmek için slaytı 2x SSC’de kısa bir süre durulayın. 100-200 μL (bölümün büyüklüğüne bağlı olarak dokuyu tamamen kaplayacak kadar) Proteinaz K sindirim tamponu ekleyerek dokuyu sindirin ve RT’de 1 dakika inkübe edin.NOT: Proteinaz K sindirimi, FISH probları için erişilebilirliği daha da artırır ve otofloresanı azaltır. Sindirim süresi doku tiplerine göre optimize edilmelidir. Çoğu durumda, 1 dakikalık sindirim yeterlidir. Aşırı sindirim, hale şeklindeki çekirdek morfolojisine yol açar ve sindirim süresi azaltılmalıdır. Proteinaz K sindirimini hemen durdurun ve slaytı 2 dakika boyunca etanole batırarak kurutun, ardından her biri 2 dakika boyunca ve 0 etanol muamelesi yapın. 3. BALIK ve görüntüleme 2 μL FISH prob stoğunu 8 μL hibridizasyon tamponu ile seyrelterek FISH hibridizasyon karışımını hazırlayın, ardından slayta uygulayın. Numuneyi bir lamel ile örtün.NOT: Kullanılan toplam FISH prob stoğu, görüntü kalitesine bağlı olarak 0,5-4 μL arasında değişir. Sinyal çok düşükse, prob girişini artırın. Arka plan çok yüksekse, özellikle çekirdeğin dışında floresan kalıntıları gözlendiğinde FISH prob girişini azaltın. Hibridizasyon tamponu, ticari olarak satın alınan problarla sağlanan veya bölüm 1’deki gibi hazırlanan tampon olabilir. DNA’yı 75 °C’de 2-5 dakika denatüre etmek için slaytları sürgülü hendek hibridizasyon sistemi gibi sıcak bir plakaya yerleştirin. Ardından, gece boyunca hibritlemek için slaytı 37 °C’ye ayarlanmış başka bir sıcak plakaya aktarın.NOT: Sıcak plakanın hibridizasyon sırasında nemi korumak için bir su tepsisi veya rezervuarı varsa, lamel kauçuk çimento ile sızdırmaz hale getirilmelidir. Hibridizasyondan sonra, sürgünü %0,3 IGEPAL CA-630 yıkama tamponu ile 40-60 °C ısıtılmış 0,4x SSC’ye batırın, ardından lamel dikkatlice çıkarın. Karanlıkta her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkamaya devam edin, ilk 10-15 saniye boyunca çalkalayın.NOT: Sürgünü yıkama tamponuna daldırmak, lamellerin nazikçe serbest kalmasına yardımcı olur. Slaytı SSC’de% 0.1 IGEPAL CA-630 ile karanlıkta RT’de 5 dakika boyunca, ilk 10-15 saniye boyunca çalkalayarak yıkayın. Otofloresanı söndürmek için, slaytı otofloresan söndürme kiti ile tedavi edin (Malzeme Tablosuna bakın) 150 μL reaktif (50 μL + 50 μL reaktif A, B, C) 2-5 dakika, ardından 2x SSC ile 5 dakika yıkayın.NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır. Doku otofloresansı esas olarak kollajen ve elastin gibi hücre dışı matriks bileşenlerinden kaynaklanır. Ayrıca lipofuscin, NADPH ve flavin koenzim içeriği nedeniyle lizozomlar ve mitokondriden önemli ölçüde etkilenir. Aldehit fiksasyonu ve kan hücresi varlığı da otofloresanı iyiartırabilir 13,14. Slaytı DAPI ile 10 dakika boyayın. Slaytı 2x SSC tamponu ile 5 dakika durulayın.NOT: Slayt, otofloresan söndürme kiti tarafından işlenmezse, DAPI boyaması 2 dakikaya düşürülebilir. Slaytı 1 saniyeden fazla olmamak üzere hızlı bir şekilde deiyonize suya batırın, ardından bir kağıt havluyla fazla nemi emerek hızlı bir şekilde kurulayın.NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır. Deiyonize su arıtma, slayt üzerinde SSC tamponunun tuz kristali birikmesini etkili bir şekilde önler ve görüntüleme kalitesini artırır. Bununla birlikte, bu kadar düşük iyon koşulları altında, FISH probu ile hedeflenen DNA arasındaki hidrojen bağları zayıflar, bu da probun ayrışmasına ve sinyal kaybına yol açar. Bu nedenle, su arıtma adımını çok kısa bir süre için korumak çok önemlidir. Sürgüyü kurutun, ardından antifade montaj ortamı ile monte edin. Görüntülemeden önce lameli oje ile kapatın.NOT: Sürgü, otomatik floresan söndürme reaktifi ile işlenmişse, sürgüyü üreticinin talimatına göre bir antifade montaj ortamı ile monte edin. Ayrıca, montaj ortamının tipine, sertleşmeye veya sertleşmemeye bağlı olarak, numunenin mühürleme ve görüntülemeden önce 1-24 saat kürlenmesi gerekir. Görüntüleme için en iyi kırılma indisini elde etmek için numunenin en az gece boyunca kürlenmesi önerilir. Floresan sinyalini yakalamak için 60× yağ lensi kullanın. Odağı ayarlamak için DAPI kanalını kullanın. Birden fazla Z yığını elde ettiğinizden emin olun. Tipik olarak, 1 μm aralıklı 5-10 z-yığını yeterlidir. En iyi çözünürlüğü elde etmek için maksimum 3D projeksiyon gerçekleştirin. Görüntü kalitesini daha da iyileştirmek için evrişim giderme veya diğer arka plan temizleme algoritmaları uygulayın.