通过荧光原位杂交对福尔马林固定石蜡包埋样品中的基因扩增进行稳健检测

该研究方案得到了德克萨斯大学西南医学中心机构审查委员会 （IRB） 的批准。手术前获得所有患者的知情同意。 1. 试剂和材料制备 在通风橱中制备 0.2 N 氯化钠 （HCl） 溶液，将 8.212 mL HCl（37% w/w 或 12.1 N）缓慢加入 491.788 mL ddH2O。在室温 （RT） 下储存。注意： 慢慢向水中加入酸。不要向酸中加水。 通过将 1.47 g 柠檬酸三钠（二水合物）溶解在 400 mL ddH2O 中，制备 10 mM 柠檬酸溶液 （pH 6.0），使用 HCl 调节至 pH 6.0，然后用 ddH2O 将最终体积降至 500 mL。将缓冲液储存在 RT 中。 通过将 100 μL Tween-20 添加到 900 μL ddH2O 中来制备 10% Tween-20 溶液。将其储存在 RT 中。 通过将 5 mL IGEPAL CA-630 添加到 45 mL ddH2O 中来制备 10% IGEPAL 溶液。将其储存在 RT 中。 通过将 44.1 g 柠檬酸三钠（二水合物）和 87.65 g 氯化钠 （NaCl） 溶解在 900 mL ddH2O 中，制备 20x SSC（pH 7.0,3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠）溶液。使用 HCl 调节至 pH 7.0，然后用 ddH2O 将最终体积降至 1000 mL。将缓冲液储存在 RT 中。 通过将 100 mL 的 20x SSC 添加到 900 mL 的 ddH2O 中来制备 2x SSC 溶液。如有必要，添加 0.5 mL 防腐剂（材料表）。将其储存在 RT 中。 通过混合 910 μL ddH2O、500 μL 20x SSC、50 μL 10% Tween-20、40 μL RNase A、1 mL 50% 葡聚糖硫酸盐和 2.5 mL 甲酰胺来制备探针杂交缓冲液。分装到 1 mL 中并储存在 -20 °C 下。 通过混合 100 mL 的 2x SSC、15 mL 的 10% IGEPAL 和 385 mL 的 ddH2O，制备含有 0.4% IGEPAL 溶液的 0.4x SSC。 通过将 5 mL 的 10% IGEPAL 添加到 495 mL 的 2x SSC 溶液中，制备含有 0.1% IGEPAL 的 2x SSC。将其储存在 RT 中。 使用前，向 99 μL Tris-EDTA 缓冲液中加入 1 μL 蛋白酶 K，新鲜制备蛋白酶 K 消化缓冲液。 通过将 1 mg DAPI 溶解到 1 mL ddH2O 中来制备 1 mg/mL DAPI 储存原液。将其储存在 -20 °C 且避光。通过将 1 μL 的 DAPI 储存储备液添加到 999 μL 的 2x SSC 溶液中来制备 DAPI 工作溶液。使用前避光保存。 2. 样品前处理 注：此处使用的载玻片包含标本。 将载玻片在 60-90°C 下老化 20 分钟或过夜（图 1）。注：此步骤有助于石蜡熔化。通常，加热 20 分钟就足够了。它可以延长到通宵以适应时间表。 通过将载玻片浸入二甲苯或其替代品中，在 Coplin 罐中 10 分钟来脱蜡。用新鲜的二甲苯或其替代品重复此步骤。在 Coplin 染色缸中执行以下所有预处理和洗涤步骤。注意：二甲苯替代品是二甲苯的安全环保替代品。其中一种替代品（见 材料表）的性能与二甲苯一样好，甚至更好。虽然二甲苯替代品产生的气味比二甲苯少，但建议在通风橱内使用。如果无法获得二甲苯替代品，则所有程序都与基于二甲苯的脱蜡兼容，无需任何更改。 用 100% 乙醇洗去二甲苯替代品 5 分钟。 用 70% 乙醇浸泡玻片再水化 5 分钟。 将载玻片在 RT 下浸入 0.2 N 盐酸 （HCl） 中 20 分钟。注：HCl 可有效提取酸溶性蛋白，如碱性核蛋白，以提高 DNA 对 FISH 探针的可及性11。 将玻片浸入 10 mM 热柠檬酸溶液中，并在 90-95 °C 下孵育 20 分钟。注：在高温下进行柠檬酸处理同样可提取酸溶性蛋白质。两种酸处理都被认为可以提取细胞外基质蛋白以减少自发荧光12。建议在将柠檬酸溶液应用于玻片之前将其预热至所需的温度范围。微波炉可能是一种方便的方式。水浴，例如使用真空低温烹调器，是高温培养最有效、最经济的解决方案。 在 2x SSC 中短暂冲洗载玻片以中和 pH 值。 通过添加 100-200 μL（足以完全覆盖组织，取决于切片的大小）蛋白酶 K 消化缓冲液消化组织，并在室温下孵育 1 分钟。注：蛋白酶 K 消化进一步增加了 FISH 探针的可及性并减少了自发荧光。消化时间应根据组织类型进行优化。在大多数情况下，1 分钟的消化就足够了。过度消化导致光晕状细胞核形态，应减少消化时间。 立即停止蛋白酶 K 消化，将载玻片浸入 70% 乙醇中 2 分钟，然后分别进行 85% 和 100% 乙醇处理 2 分钟，使载玻片脱水。 3. FISH 和成像 用 8 μL 杂交缓冲液稀释 2 μL FISH 探针原液，制备 FISH 杂交混合物，然后将其涂在载玻片上。用盖玻片盖住样品。注：使用的总 FISH 探针原液范围为 0.5-4 μL，具体取决于图像质量。如果信号太低，请增加探头输入。如果背景太高，请减少 FISH 探针的输入，尤其是当观察到细胞核外的荧光碎片时。杂交缓冲液可以是市售探针随附的杂交缓冲液，也可以是第 1 节中制备的杂交缓冲液。 将载玻片放在热板上，例如载玻片护城河杂交系统，使 DNA 在 75 °C 下变性 2-5 分钟。然后，将载玻片转移到另一个设置为 37 °C 的热板上以杂交过夜。注意：如果热板有水盘或储水池以在杂交过程中保持湿度，则无需用橡胶水泥密封盖玻片。 杂交后，将载玻片浸入 40-60 °C 加热的 0.4x SSC 和 0.3% IGEPAL CA-630 洗涤缓冲液中，然后小心地取下盖玻片。继续洗涤两次，每次在黑暗中洗涤 5 分钟，前 10-15 秒搅拌。注意：将玻片浸入洗涤缓冲液中有助于轻轻释放盖玻片。 在黑暗中，在 RT 下用 0.1% IGEPAL CA-630 在 SSC 中洗涤载玻片 5 分钟，搅拌前 10-15 秒。 为了淬灭自发荧光，使用自发荧光淬灭试剂盒（参见 材料表）处理载玻片，应用 150 μL 试剂（50 μL + 50 μL + 50 μL 试剂 A、B、C）2-5 分钟，然后用 2x SSC 洗涤 5 分钟。注意：这是一个可选步骤。组织自发荧光主要来源于细胞外基质成分，例如胶原蛋白和弹性蛋白。由于溶酶体和线粒体的脂褐素、NADPH 和黄素辅酶含量，它也受到溶酶体和线粒体的显着影响。醛固定和血细胞的存在也可能很好地增加自发荧光13,14。 用 DAPI 对载玻片染色 10 分钟。用 2x SSC 缓冲液冲洗载玻片 5 分钟。注：如果玻片未使用自发荧光淬灭试剂盒处理，则 DAPI 染色可缩短至 2 分钟。 将玻片快速浸入去离子水中不超过 1 秒，然后用纸巾吸收多余的水分快速干燥。注意：这是一个可选步骤。去离子水处理可有效防止 SSC 缓冲液在玻片上沉积盐晶，提高成像质量。然而，在这种低离子条件下，FISH 探针和靶向 DNA 之间的氢键被削弱，导致探针解离和信号丢失。因此，在很短的时间内维持水处理步骤至关重要。 擦干载玻片，然后用抗淬灭封固剂封片。成像前用指甲油密封盖玻片。注：如果玻片经过自发荧光淬灭试剂处理，请按照制造商的说明使用抗淬灭封固剂封片。此外，根据封固剂的类型，硬化或不硬化，样品必须在密封和成像前固化 1-24 小时。建议样品至少固化过夜，以达到成像的最佳折射率。 使用 60× 油镜捕获荧光信号。使用 DAPI 通道调整焦点。确保获取多个 Z 堆栈。通常，5-10 个 z 堆栈（间隔为 1 μm）就足够了。执行最大 3D 投影以获得最佳分辨率。应用反卷积或其他背景清除算法以进一步提高图像质量。