الكشف القوي عن تضخيم الجينات في العينات المضمنة بالبارافين الثابتة بالفورمالين عن طريق التهجين الفلوري في الموقع
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لتصور تضخيم الجينات في عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين (FFPE) المثبتة بالفورمالين.
Abstract
يلعب تضخيم الجينات البؤري، مثل الحمض النووي خارج الكروموسومات (ecDNA)، دورا مهما في تطور السرطان ومقاومة العلاج. في حين أن المنهجيات القائمة على التسلسل تمكن من تحديد غير متحيز للحمض النووي ecDNA ، فإن التقنيات القائمة على الوراثة الخلوية ، مثل التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، تظل فعالة من حيث الوقت والتكلفة لتحديد ecDNA في العينات السريرية. يوفر تطبيق FISH في عينات الأنسجة المثبتة بالبارافين (FFPE) وسيلة فريدة للكشف عن الجينات المضخمة ، خاصة عندما لا تتوفر عينات قابلة للحياة لفحص النمط النووي. ومع ذلك ، هناك نقص في إجراءات توافق الآراء لهذه التقنية. يوفر هذا البروتوكول تعليمات شاملة ومحسنة بالكامل خطوة بخطوة لإجراء FISH للكشف عن تضخيم الجينات ، بما في ذلك ecDNA ، في عينات أنسجة FFPE التي تمثل تحديات فريدة يهدف هذا البروتوكول إلى التغلب عليها وتوحيدها. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين الحصول على بيانات تصوير عالية الجودة لتقييم تضخيم الجينات.
Introduction
تعد دراسة تضخيم الجينات السرطانية البؤرية أمرا بالغ الأهمية لأنها تدفع تكوين السرطان وتقدمه ومقاومة العلاج1. الأهم من ذلك ، قد تتضخم الجينات المسرطنة والجينات المناعية كحمض نووي خارج الكروموسومات (ecDNA) ، والتي يعزز وراثتها غير المتماثلة عدم التجانس الجيني في السرطان 2,3. تم ربط ecDNA بمقاومة العلاج والنتائج السريرية غير المواتية4،5،6.
تمثل عينات الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE) موردا أرشيفيا واسعا في مختبرات علم الأمراض ، مما يوفر معلومات وفيرة للدراسات بأثر رجعي. ومع ذلك ، فإن استخراج البيانات الجزيئية من عينات FFPE من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التسلسل يمثل تحديا بسبب تجزئة الحمض النووي وتدهوره وربطه أثناء التثبيت7. من بين مجموعة التقنيات المتاحة للتحليل الجزيئي لأنسجة FFPE ، أثبت التهجين الفلوري في الموقع (FISH) فعاليته في تصور تسلسلات الحمض النوويالمحددة 8.
على الرغم من تقدم تقنيات التشخيص الجزيئي الحديثة ، فإن قدرة FISH على تصور وقياس تضخيم الجينات على مستوى الخلية الواحدة توفر رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الورم والنتائج السريرية. باستخدام مجسات موسومة بالفلورسنت مكملة للجين المستهدف محل الاهتمام ، يمكن ل FISH حل توطين الجين الورمي بسهولة وقد يستنتج شكل تضخيم الجينات المسرطنة (مثل ecDNA) داخل الخلايا الفردية ، وهو أمر مستحيل أو مكلف من خلال تقنيات أخرى. لذلك ، يوفر FISH طريقة اقتصادية لتقييم عدم تجانس الورم والتطور النسيلي9. علاوة على ذلك ، سهلت التطورات في الأتمتة والتصوير والتحليل الحسابي التحليل عالي الإنتاجية لبيانات FISH ، مما مكن من القياس الكمي القوي لتضخيم الجينات عبر مجموعات الأنسجة الكبيرة10.
ومع ذلك ، فإن تطبيق FISH على أنسجة FFPE يمثل تحديات متأصلة ، بما في ذلك القطع الأثرية المتشابكة والتألق الذاتي في الخلفية. يتطلب التغلب على هذه العقبات تحسينا دقيقا لكل إجراء لضمان نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. توفر هذه الورقة بروتوكولا محسنا خطوة بخطوة لتطبيق FISH للتحقيق في تضخيم الجينات في عينات أنسجة FFPE. باستخدام مسبار يستهدف موضع الجين ERBB2 (HER2) ، أثبتنا أن FISH يمكنه اكتشاف حالة تضخيم ERBB2 بقوة في عينات FFPE من مرضى سرطان الثدي. من الممكن حتى تقدير ما إذا كان ERBB2 يتم تضخيمه على أنه ecDNAs. من خلال تجميع الأدبيات الموجودة ونتائجنا التجريبية ، نوضح الاعتبارات المنهجية والتحديات التقنية والمزالق المحتملة للتحليل القائم على FISH. نناقش أيضا الأهمية السريرية لتوصيف التضخيم الجيني في أنواع مختلفة من السرطان ، مع تسليط الضوء على أهميتها النذير وإمكاناتها للاستراتيجيات العلاجية الشخصية.
باختصار ، تؤكد هذه الورقة على أهمية FISH كأداة قيمة لدراسة تضخيم الجينات في عينات أنسجة FFPE ، وتقديم رؤى لا مثيل لها في بيولوجيا الورم وتوجيه عملية صنع القرار السريري في علم الأورام. مع استمرار التحسين والتكامل مع المقايسات الجزيئية التكميلية ، يقف التحليل القائم على FISH على أهبة الاستعداد لزيادة تعزيز فهمنا لمسببات السرطان وتحسين نتائج المرضى في عصر الطب الدقيق.
Protocol
Representative Results
Discussion
FISH هو خيار سريع وبأسعار معقولة للتشخيص الوراثي الخلوي. خاصة في تحديد ما إذا كان ecDNA موجودا في السرطان ، تظل أدلة FISH هي المعيار الذهبي1. يسمح FISH في أنسجة FFPE بالتحديد السريع لحالة الجينات في عينات خزعة المريض ، مما يسمح بتشخيص أسرع وتتبع التغييرات طوال تقدم المرض. هذه التقنية ذات قيمة خاصة لاختبار العينات السريرية التي تم جمعها بالفعل لعلم الأمراض.
يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الخطوة الأولى هي إزالة البارافين الشاملة. يمكن أن يعطل البارافين المتبقي تهجين FISH. إذا كانت العينة لا تزال تبدو شمعية بعد الخطوة 2 ، فيجب معالجتها مرة أخرى بالزيلين الطازج أو بدائله.
ثانيا ، استخراج البروتين والهضم أمر بالغ الأهمية. لا تعزز هذه العمليات إمكانية وصول الحمض النووي إلى مسبار FISH فحسب ، بل تقلل أيضا بشكل كبير من التألق التلقائي. يتضمن هذا البروتوكول ثلاث خطوات لإزالة البروتين. في حين أن العلاج ب 0.2 N HCl و 10 mM من حامض الستريك واضح ومباشر ، فقد يتطلب هضم البروتين K التحسين. الإفراط في الهضم هو الخطأ الأكثر شيوعا عند استخدام البروتيناز K ، مما يؤدي إلى نوى على شكل هالة. سيؤدي تقصير وقت الهضم إلى تحسين مورفولوجيا النوى. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بعدم هضم أكثر من أربع عينات في وقت واحد لتقليل فارق التوقيت بين العينة الأولى والأخيرة. من المهم ملاحظة أنه حتى النواة السليمة قد تظهر كهالة تحت المجهر عالي التكبير وعالي الدقة. وذلك لأن النواة ليست على المستوى البؤري نفسه. لذلك ، يقترح أخذ مداخن Z متعددة وإجراء إسقاط أقصى لفحص التشكل النووي.
أخيرا ، يوصى بتبريد التألق الذاتي. على الرغم من أن استخراج الحمض وهضم البروتيناز K يمكن أن يقلل بشكل كبير من الخلفية المشتقة من البروتين ، إلا أن مستقلبات الفلورسنت قد لا تزال تؤثر على جودة التصوير.
بينما يوفر FISH دقة مكانية لا مثيل لها في تحديد تضخيم الجينات البؤري ، إلا أن له قيودا. أولا ، المحتوى والإنتاجية منخفضان مقارنة بنهج PCR أو تسلسل الجيل التالي (NGS). عادة ، يمكن تطبيق واحد إلى ثلاثة مجسات FISH بألوان مختلفة على شريحة واحدة بدون معدات متخصصة. ومع ذلك ، فإن التقدم في تقنيات الأتمتة جعل FISH عالي المحتوى وعالي الإنتاجية ، مثل التسلسل في الموقع 21 ، ممكنا. ثانيا ، يتطلب تصميم مسبار FISH معلومات مسبقة. وقد مكنت الجهود الجارية لتحديد أحداث التضخيم البؤري المتكررة في السرطان من إنشاء لوحات FISH مصممة مسبقا للتطبيقات المختبرية والسريرية. على سبيل المثال ، غالبا ما يتم تضخيم الجينات المسرطنة من عائلة MYC على أنها ecDNA في سرطان الرئة ذو الخلايا الصغيرة للتوسط في مقاومة العلاج الكيميائي. لذلك ، يمكن للوحة FISH التي تستهدف جينات MYC و MYCL و MYCN تسريع تحديد استجابات العلاج في الخزعات. وبالمقارنة ، يسمح NGS بفحص أكثر حيادية للجينات ذات الأهمية. ومع ذلك ، من بين التقنيات القائمة على NGS ، فقط تسلسل الجينوم الكامل مع تحليل مكلفللحساب 22 يمكن أن يميز ecDNA.
باختصار ، نقدم تعليمات قوية وشاملة للتحقيق في تضخيم الجينات البؤري في عينات FFPE. من خلال فحص نمط إشارة FISH ، يصبح من الواضح بشكل لا لبس فيه ما إذا كان يتم تضخيم موضع الجين وكيفية ذلك. نتوقع دمج التعلم الآلي في تحليل الصور23 من نوى الطور البيني لاستخراج المعلومات الوراثية الخلوية فيما يتعلق برقم النسخ وشكل التضخيم (كروموسوم أو ecDNA) ، وبالتالي تبسيط عملية التشخيص الجزيئي وتعزيز فهمنا للآليات المسببة للأمراض في السرطان.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SW هو باحث ومدعوم من معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (RR210034)
Materials
| DAPI | Tocris Bioscience | 5748 | Nucleus staining |
| Dextran sulfate 50% solution | EMD Millipore Sigma | S4030 | Probe hybridization buffer |
| ERBB2 (HER2) FISH Probe | Empire Genomics | ERBB2-20-RE | FISH probe |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Dehydrating and hydrating tissue |
| Formamide | Thermo Scientific Chemicals | 205821000 | Probe hybridization buffer |
| Formula 83 (Xylene substitute) | CBG Biotech | CH0104A | Removing paraffin |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | Sample pretreatment |
| IGEPAL CA-630 | Thermo Scientific Chemicals | J19628K2 | Slide washing |
| Proclin 300 | Sigma-Aldrich | 48914-U | Preservative for SSC buffer (optional) |
| Proteinase K (800 units/mL) | New England Biolabs | P8107S | Protein digestion |
| RNase A (20 mg/mL) | New England Biolabs | T3018L | Probe hybridization buffer |
| Slide Moat Hybridization System | Boekel Scientific | 280001 | Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable. |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S2713 | SSC buffer |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher BioReagents | FLBP3271 | SSC buffer and sample pretreatment |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher BioReagents | BP2473500 | Proteinase K digestion buffer |
| Tween-20 | Fisher BioReagents | BP337-500 | Probe hybridization buffer |
| Vectashield antifade mounting media | Vector Laboratories | H190010 | Slide mounting |
| Vector TrueVIEW | Vector Laboratories | SP8400 | Autofluorescence quenching kit |
Referenzen
- ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
- Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer. Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).
- Luebeck, J., et al. Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett’s oesophagus. Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).
- Nathanson, D. A., et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 343 (6166), 72-76 (2014).
- Kim, H., et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).
- Pal Choudhuri, S., et al. Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs. Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).
- Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature. Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).
- Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors. Molecules. 25 (8), 1864 (2020).
- Cui, C., Shu, W., Li, P. Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications. Front Cell Dev Biol. 4, 89 (2016).
- Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR Protoc. 2 (3), 100741 (2021).
- Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections. Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).
- Richardson, S. O., et al. One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides. Mol Cytogenet. 12, 27 (2019).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. bioRxiv. , (2023).
- Lange, J. T., et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).
- Hung, K. L., et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).
- Storlazzi, C. T., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure. Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).
- Guerin, T. M., Marcand, S. Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery. Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).
- Nguyen, H. Q., et al. 3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing. Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).
- Deshpande, V., et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 10 (1), 392 (2019).
- Rajkumar, U., et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 21, 428-435 (2019).
.