Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

Leah Gauthier; Brian D. Wagner; Sue Boyetchko; Christopher  W. Kirby

doi:10.3791/66967

JoVE Journal > Biochemistry

Biochemie

Identificação guiada por bioensaio de produtos naturais para biocontrole por cromatografia em camada delgada - bioautografia direta

Published: July 26, 2024

doi:

10.3791/66967

Leah Gauthier^1,2, Brian D. Wagner², Sue Boyetchko³, Christopher W. Kirby^1,2

¹Charlottetown Research and Development Centre,Agriculture and Agri-Food Canada, ²Department of Chemistry,University of Prince Edward Island, ³Saskatoon Research and Development Centre,Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

Descrevemos o uso de cromatografia em camada delgada, ensaio de bioautografia direta e cromatografia líquida-espectrometria de massa para identificar produtos naturais microbianos que apresentam antagonismo contra patógenos fúngicos usando o patógeno Sclerotinia sclerotiorum e isolados de Bacillus biopesticidas como sistema modelo.

Abstract

A bioautografia direta por cromatografia em camada delgada (TLC-DB) é um bioensaio bem estabelecido usado para separar e identificar produtos naturais (NPs) que são antagônicos contra um patógeno alvo. É uma opção rápida, barata e simples para o isolamento guiado por bioensaio e identificação de NPs que depende da separação por TLC juntamente com a aplicação direta de um patógeno alvo para examinar a bioatividade. É normalmente usado para a análise de extratos de plantas bioativas, detectando atividade inibitória contra bactérias, fungos e enzimas. Dito isto, tem um grande potencial na descoberta de NPs bacterianas, particularmente para avaliar NPs bacterianas contra patógenos agrícolas pertinentes, o que é valioso para descobrir e desenvolver novos biopesticidas para a indústria agrícola. Além disso, é um protocolo sintonizável que pode ser aplicado a outros patógenos alvo ou fontes de NPs em programas de pesquisa relacionados à descoberta e identificação de compostos bioativos. Aqui, descrevemos um sistema modelo para descoberta e identificação de NPs de biopesticidas usando TLC-DB com Bacillus spp. e o patógeno agrícola Sclerotinia sclerotiorum.

Introduction

Os patógenos agrícolas fúngicos causam perdas significativas na qualidade e na produtividade das culturas em todo o mundo, contribuindo para os desafios econômicos e de abastecimento de um sistema global estável de produção de alimentos ^1,2. Os danos causados por patógenos podem ser evitados com o melhoramento de cultivares resistentes à infecção e o uso de sistemas integrados de manejo de culturas, incluindo rotações de culturas e práticas de manejo da terra para suprimir a proliferação de patógenos ^3,4. Embora esses métodos reduzam os danos às plantações, os pesticidas químicos são geralmente usados em conjunto para matar ativamente as estruturas reprodutivas fúngicas no campo e evitar danos e reduções de rendimento. Embora eficaz, o uso de pesticidas químicos tem muitas desvantagens, incluindo danos aos ecossistemas circundantes, declínio na fertilidade do solo, riscos associados à saúde humana e o desenvolvimento de resistência a patógenos, este último causando a necessidade de doses mais altas de pesticidas a cada ano ^5,6,7.

Os produtos de controle de pragas e patógenos de base microbiana há muito são considerados alternativas potenciais ou complementares aos pesticidas sintéticos. Desde o início dos anos 1900, o Bacillus thuringiensis tem sido amplamente utilizado para controlar pragas e patógenos agrícolas como tratamento de sementes, pulverização foliar e tratamento direto do solo⁸. Esses produtos foram denominados biopesticidas e são caracterizados como microrganismos ou bioquímicos naturais que podem matar, suprimir ou reduzir o vigor de uma praga ou patógeno alvo. Os biopesticidas podem controlar o crescimento de um patógeno por meio de vários mecanismos, mas mais comumente o fazem por meio da secreção de metabólitos secundários⁹. Os metabólitos secundários, muitas vezes chamados de produtos naturais, não estão envolvidos no metabolismo primário, mas são produzidos como uma vantagem evolutiva para superar outros microrganismos¹⁰.

Os biopesticidas oferecem muitas vantagens sobre seus equivalentes sintéticos. Eles representam um baixo risco de toxicidade para o meio ambiente, fauna e humanos em comparação com produtos sintéticos de manejo de pragas ^9,10. Como a maioria dos biopesticidas existe naturalmente no meio ambiente há milênios, existem vias de biodegradação para metabólitos microbianos no meio ambiente, limitando a possibilidade de contaminação do solo ou do ecossistema e reduzindo os tempos de residência que contribuem para que os pesticidas sintéticos sejam tão destrutivos para o meio ambiente¹¹. Além disso, muitos biopesticidas usados para mitigar a infecção por patógenos também exibem propriedades promotoras do crescimento das plantas, o que pode aumentar a biodisponibilidade de nutrientes e induzir a resistência sistêmica das plantas¹².

Mais comumente, os biopesticidas são aplicados na forma de inóculo microbiano e os NPs são secretados por microrganismos vivos in situ^12,13. Nesse caso, identificar a fonte da atividade de um biopesticida é de grande valia. Isso fornece informações sobre o mecanismo de ação do biopesticida, ajuda na construção de um caso para a proteção de um microrganismo com patente e pode ter um impacto científico significativo se suas estruturas forem novas. Mais importante, no entanto, a identificação da fonte bioativa informa as possibilidades de formulação de um produto biopesticida a jusante. Se o próprio NP estiver ativo, pode-se usar o microrganismo como uma fábrica de biomoléculas para a produção de biopesticidas em larga escala. Além disso, muitos NPs que foram explorados para biocontrole também têm aplicações potenciais na medicina humana, tornando-os ainda mais valiosos economicamente⁸.

Os ensaios de bioautografia direta por cromatografia em camada delgada (TLC-DB) são um método barato e direto para o isolamento guiado por bioatividade e identificação de metabólitos biopesticidas. Embora a técnica seja comumente utilizada para separar o teste de bioatividade de fitoquímicos de extratos vegetais brutos, ela também tem grande potencial para a análise de extratos microbianos¹⁴. O TLC fornece separação rápida e barata de NPs em um extrato microbiano bruto e, após o revestimento com uma suspensão de patógeno de meio, as zonas que contêm metabólitos ativos são facilmente visualizadas. Essas zonas podem ser raspadas da placa e extraídas para análise química por cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) para identificar metabólitos conhecidos. Os metabólitos que não correspondem aos compostos relatados anteriormente podem ser isolados em maiores quantidades por cromatografia líquida para serem submetidos a estudos de elucidação da estrutura usando técnicas como espectroscopia de ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios-X¹⁵.

Este artigo descreve um sistema modelo para descoberta e identificação de NPs de biopesticidas usando TLC-DB com Bacillus spp. e o patógeno agrícola Sclerotinia sclerotiorum. A Figura 1 fornece uma visão geral esquemática do procedimento TLC-DB.

Figura 1: Visão geral esquemática das etapas 4-7 do procedimento do TLC-DB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. 1. Seleção dos candidatos de biocontrole microbiano Usando ensaios de placa de competição, selecione isolados microbianos que exibem antagonismo contra o patógeno de interesse.NOTA: Nove isolados de Bacillus que exibiram antagonismo contra S. sclerotiorum foram selecionados, incluindo as espécies Bacillus atrophaeus, mojavensis e subtilis , para demonstrar este protocolo. 2. Preparação de mídia Prepare o ágar dextrose de batata (PDA) dissolvendo 39 g de meio por litro de água. Prepare o ágar Pseudomonas F adicionando 45 g de meio por litro de água. Prepare o caldo de batata dextrose (PDB) com 1% de ágar adicionando 24 g de meio e 0,24 g de ágar por litro de água. Prepare o caldo de levedura-glicose-manganês (YGM). Crie uma solução tampão consistindo de 2,5 g de KH2PO4 e 2,5 g K2HPO4 em 100 mL de água e uma solução salina consistindo de 0,58 g de MnSO4. H20, 0,5 g de NaCl e 0,05 g de FeSO4,7H 20 em 100 mL de água.Em seguida, adicione 1 g de extrato de levedura, 1,25 g de dextrose, 400 mL de água, 5 mL da solução tampão, 5 mL da solução salina e 90 mL de água para garantir que os sais metálicos não precipitem na solução. Esterilize em autoclave o meio, despeje o ágar em placas de Petri de 100 x 15 mm e deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de usar. 3. Preparação de patógenos Cultivar cinco placas de Sclerotinia sclerotiorum em BDA (preparadas no passo 2.1) e incubar a 25 °C durante 3 dias. 4. Preparação natural do extrato do produto Cultivar cada isolado bacteriano em ágar Pseudomonas F (preparado no passo 2.2) e crescer até que sejam observadas colónias individuais. Subcultive colônias bacterianas únicas em 25 mL de meio YGM em centrífuga ou tubos de cultura e incube com agitação por 3 dias. Transferir 5 ml de alíquotas de cada extracto para 1 L de YGM e incubar nas mesmas condições durante mais 3 dias. Centrifugue cada cultura a 3000 x g por 15 min a 25 ° C para granular as células. Transvasar e lavar o sobrenadante três vezes com acetato de etilo para extrair os metabolitos do meio de cultura. Combinar e secar a camada de acetato de etilo de cada um por evaporação rotativa. Dissolva novamente o extrato em metanol mínimo, transfira-o para um pequeno frasco de cintilação e seque-o novamente por evaporação rotativa.NOTA: Se o extrato secar em um material oleoso ou resinoso, liofilize o material para obter um pó seco que possa ser pesado com precisão. 5. Preparação da placa TLC Prepare a placa TLC de 20 cm x 20 cm desenhando uma linha a 2 cm da parte inferior e a 2 cm da parte superior da placa. Na linha inferior, coloque nove pontos separados por 2 cm. Acima da linha superior, coloque quatro pontos separados por 4 cm. Dissolver 5 mg de cada extracto em 15 μL de metanol e aplicar 5 μl de cada extracto nos nove pontos marcados na linha inferior com uma pipeta. Deixar secar cada ponto de extracto na placa de TLC e aplicar mais 5 μL de alíquota no mesmo local. Repita até que todo o material esteja carregado na placa TLC. Desenvolver a placa TLC num tanque de revelação utilizando uma solução 1:2 de diclorometano e metanol até que o solvente atinja a linha marcada a 2 cm do topo da placa (aproximadamente 45 min). Uma vez desenvolvida, remova a placa TLC e aplique uma série de controles positivos nos quatro pontos marcados acima da linha de solvente. Utilizam-se quatro concentrações do mesmo controlo. Para S. scl., 0,5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL e 500 μg/mL de higromicina B são controles positivos. Antes que todo o solvente evapore da placa, coloque-o em uma caixa de placa TLC esterilizada com etanol. 6. Ensaio de bioautografia direta Autoclave os materiais a serem usados no ensaio (componentes de vidro do pulverizador de cromatografia, espátula de metal, quatro folhas de papel toalha, celulose ou papel de filtro, água e meio) em um copo grande coberto com papel alumínio.NOTA: Os materiais de papel (papel toalha, papel de celulose) devem ser embrulhados em papel alumínio para evitar que se molhem na autoclave. Conecte uma fonte de ar, manômetro e pulverizador de cromatografia usando tubulação de PTFE esterilizada com etanol. Conecte um filtro HEPA entre o pulverizador de cromatografia e o manômetro. Colete o tapete micelial das cinco placas de patógenos usando a espátula de metal estéril em um tubo de centrífuga de 50 mL usando uma espátula estéril.NOTA: Use um pequeno volume de caldo líquido para ajudar a desalojar os micélios, se necessário, e transfira com uma pipeta estéril. Adicione 25 mL de PDB corrigido com ágar e esferas de vidro estéreis ao tubo de centrífuga de 50 mL e vórtice por 5 min para quebrar o tapete micelial. Transfira a suspensão micelial para um pulverizador de cromatografia usando uma seringa estéril com ponta de agulha para garantir que grandes pedaços de micélio não entupam o pulverizador de cromatografia. Coloque as placas TLC desenvolvidas anteriormente em toalhas de papel estéreis em uma capa de fluxo laminar para reduzir o contato da mão com a placa durante a aplicação da suspensão do meio. Aumente a pressão do ar para aproximadamente 4 bar e aplique três camadas da suspensão na placa TLC, permitindo que a placa seque completamente entre as aplicações.NOTA: Três camadas foram consideradas a quantidade ideal. Menos do que isso, e o patógeno não tem meio suficiente para crescer. Mais do que isso, o meio é muito espesso, o que pode não permitir o contato do patógeno com metabólitos ativos. Adicione 500 mL de água estéril em uma caixa de plástico esterilizada e coloque folhas de celulose dobradas esterilizadas ou papel de filtro em cada lado para reter a umidade. Coloque a placa de ensaio concluída em quatro placas de Petri vazias na caixa. Incube o ensaio por 3 dias a 1 semana ou até que uma camada uniforme de micélios cresça uniformemente na placa de TLC, exceto em torno dos controles positivos e da zona de inibição (ZOIs). 7. Análise por espectrometria de massa por cromatografia líquida Fotografe o ensaio concluído usando fotografia. Calcule o fator de retenção para cada zona de inibição dividindo a distância da linha inferior ao ZOI pela distância da linha inferior à linha superior. Raspe a sílica das zonas de inibição e coloque-a em tubos de microcentrífuga. Adicione 500 μL de metanol a cada tubo e vórtice para extrair os metabólitos da sílica. Centrifugue a 8.500 x g a 20 °C por 10 min e transfira o sobrenadante para um pequeno frasco. Evaporar até à secura por evaporação rotativa ou sob uma corrente de azoto. Ressuspenda o extrato em 50 μL de metanol em um frasco para injetáveis LC. Analisar os metabólitos na zona de inibição por LC-MS e compará-los com os metabólitos do extrato bruto para determinar quais metabólitos do extrato bruto são responsáveis pela inibição do patógeno16. Utilizando o gênero e as espécies do microrganismo fonte e as massas identificadas na ZOI, busque na literatura e em bases de dados relevantes como Antibase e o Dicionário de Produtos Naturais para identificar os metabólitos.

Representative Results

Após a separação dos extratos microbianos por TLC, os metabólitos devem ser dispersos ao longo da placa TLC verticalmente. Sob luz visível, pode ser difícil visualizar metabólitos que não absorvem na faixa de luz visível. Assim, a imagem sob luz ultravioleta pode ajudar a visualizar a separação de metabólitos, como visto na Figura 2A, B. Após o período de incubação, o patógeno deve parecer crescer uniformemente em toda a placa, exceto nos controles positivos e nas zonas de inibição onde residem os metabólitos ativos, ilustrados na Figura 2C. Figura 2: Separação de extratos microbianos por TLC. (A) Placa TLC desenvolvida contendo nove extratos de Bacillus fotografados sob luz visível e (B) sob luz UV de 320 nm antes da aplicação de inóculo fúngico. (C) Ensaio de bioautografia concluído com crescimento de patógenos observado em toda a placa, exceto onde o crescimento é inibido em torno dos controles positivos, e ZOI de cada extrato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Os metabólitos extraídos das zonas de inibição são analisados por LC-MS e comparados ao extrato bruto para determinar as NPs responsáveis pelo antagonismo contra o patógeno. Os metabólitos correspondentes devem ter o mesmo tempo de retenção e espécies de íons moleculares para serem considerados compatíveis. Uma vez identificados os metabólitos ativos, a cultura bacteriana pode ser cultivada a granel para isolar os metabólitos ativos de interesse para a química estrutural ou estudo biológico.

Discussion

O TLC-DB é uma ferramenta de pesquisa NP valiosa e bem estabelecida e uma alternativa simples e barata aos métodos de isolamento guiados por bioensaio de microplacas¹⁷. Requer tempo e recursos materiais mínimos em comparação com os ensaios de microplacas, que requerem separação de metabólitos usando técnicas de cromatografia líquida. É um ensaio altamente versátil que pode ser usado para detectar NPs antibacterianos, antifúngicos, antiparasitários e antioxidantes, além de inibidores enzimáticos 18,19,20,21,22,23. Embora mais comumente usado para detectar e identificar fitoquímicos bioativos, o mesmo método pode ser aplicado para NPs bacterianas, conforme explorado neste protocolo¹⁸. Além disso, o protocolo pode ser otimizado para uso com uma variedade de fontes de NP e patógenos-alvo para auxiliar na descoberta e avaliação de novos NPs bioativos.

O meio usado para o crescimento bacteriano e o solvente usado para extração podem afetar muito os resultados da descoberta de produtos naturais. O meio utilizado neste protocolo é otimizado para bactérias produtoras de lipopeptídeos cíclicos, incluindo Pseudomonas e Bacillus spp. mas outros meios e fontes de nutrientes devem ser considerados ao explorar outros gêneros. Pode-se optar por completar o TLC-DB usando o mesmo microrganismo cultivado em uma variedade de meios para avaliar toda a amplitude da diversidade de metabólitos de um isolado ou usar condições de crescimento idênticas para uma gama mais ampla de isolados. A escolha do solvente de extração também afeta os produtos naturais detectados. É geralmente entendido que a maioria dos NPs bioativos tem polaridade baixa a moderada, tornando o acetato de etila uma escolha adequada devido ao seu baixo ponto de ebulição, o que facilita a remoção. No entanto, se também se deseja examinar as frações polares e apolares, podem ser realizadas múltiplas extrações com outros solventes. Alternativamente, o extrato livre de células pode ser liofilizado e usado no ensaio para ver todos os metabólitos liberados no meio. No entanto, muitas vezes será necessário carregar mais material na placa de TLC para contabilizar os componentes de mídia seca no material liofilizado. Da mesma forma, se este método for usado com um patógeno diferente, como inóculo, o meio usado e as condições de incubação devem ser otimizados para obter as 5 placas de ágar de micélio usadas para o ensaio TLC-DB.

O TLC-DB é vantajoso em comparação com a bioautografia de contato e imersão, pois utiliza a camada mais fina de ágar e inóculo, minimizando a dependência da difusão de metabólitos na camada de ágar, o que pode permitir que quantidades menores de produtos naturais induzam a inibição do patógeno¹⁷. Achados publicados anteriormente usando métodos bioautográficos de TLC usaram uma suspensão de esporos do patógeno para completar o ensaio¹⁷. Embora isso permita um controle preciso sobre a concentração da suspensão, pode ser extremamente difícil e demorado induzir a esporulação de certos fungos²⁴. Essa modificação simplifica muito o ensaio e permite a conclusão do ensaio usando patógenos fúngicos que são difíceis de esporular e podem ter sido evitados anteriormente para este método.

A massa de extrato bacteriano usada no ensaio pode afetar os resultados. Se muito pouco extrato for aplicado à placa TLC, é possível que a concentração inibitória mínima de um composto ativo não seja ultrapassada e a bioatividade não seja detectada. Como resultado, em alguns casos, e como visto na Figura 1 e na Figura 2, vale a pena sobrecarregar a placa de CCD, comprometendo a separação para a capacidade de detectar facilmente a atividade. Da mesma forma, a carga de patógenos pulverizada na placa não deve ser muito baixa, pois não haverá meio suficiente aplicado para suportar o crescimento do patógeno. Este método pode ser facilmente ajustado para acomodar uma variedade de extratos bacterianos e patógenos, e as quantidades de extrato microbiano e inóculo descritas no protocolo garantiram que a bioatividade possa ser detectada para vários patógenos e extratos microbianos. Se não forem observadas zonas de inibição após a conclusão do ensaio, pode indicar uma das seguintes situações. Primeiro, os metabólitos ativos podem não estar presentes no extrato aplicado devido ao uso de meios incompatíveis para o crescimento bacteriano ou devido à atividade da bactéria não ser resultado da produção de NP. Um ensaio de difusão em disco com o extrato pode ser concluído para confirmar ou negar a existência de NPs ativos no extrato. Se o ensaio de difusão em disco não mostrar supressão de patógenos, outros meios podem ser testados para determinar se outras condições produzem NPs bioativas. Se o ensaio de difusão em disco indicar que o extrato suprime o patógeno, pode ser necessário aplicar uma massa maior do extrato bacteriano à placa de TLC, caso em que outro ensaio pode ser tentado.

A comparação de metabólitos no ZOI com o extrato bruto é essencial para a identificação de NPs ativos. No ensaio, os metabólitos do extrato bruto podem ser metabolizados ou modificados pelo patógeno, o que pode ser observado via LC-MS. Assim, apenas os metabólitos que ocorrem tanto no extrato bruto quanto no ZOI podem ser considerados como NPs produzidos pela bactéria em estudo. Se não for possível correlacionar os metabólitos extraídos do ZOI com os metabólitos do extrato bruto, uma placa de TLC pode ser preparada, conforme descrito na etapa 5. Sem completar o ensaio de bioautografia, extrair os metabolitos da placa TLC com o mesmo tempo de retenção observado no ensaio concluído. Isso deve permitir uma correlação mais fácil entre os metabólitos nos ZOIs e o extrato bruto, causando supressão de patógenos.

Uma desvantagem do TLC-DB é que a resolução do TLC é consideravelmente menor do que a alcançada ao usar técnicas tradicionais de triagem de micropoços, que requerem cromatografia líquida para separação. Assim, é comum que existam múltiplos metabólitos na zona de inibição, onde alguns metabólitos podem não estar contribuindo para a bioatividade. Esse problema pode ser causado ainda mais pela prática de sobrecarregar a placa TLC para observar a bioatividade com mais clareza. Trabalhos recentes foram publicados usando TLC de alto desempenho (HP-TLC), que melhora muito a resolução e pode permitir a automação do desenvolvimento de TLC que de outra forma seria impossível ao usar TLC convencional 14,21,22,23. Além disso, as placas podem ser desenvolvidas em uma segunda dimensão (2D-TLC) para separar ainda mais os metabólitos com tempos de retenção semelhantes. Dito isto, deve-se avaliar se o aumento do tempo e do custo do material é um compromisso que vale a pena para o aumento da resolução obtida com HP- e 2D-TLC²⁵.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos à Agriculture and Agri-Food Canada pelo financiamento sob o qual esta pesquisa foi possível (projetos J-001843 e J-002021). Agradecemos a Brett van Heyningen por filmar o conteúdo do vídeo para este protocolo. Também gostaríamos de agradecer aos ex-alunos de pós-graduação (Jennifer Vacon e Mark Nabuurs) por suas percepções sobre os métodos descritos neste manuscrito.

Materials

0.5-5 mL single channel Pipette	VWR	CA11020-004
10 mL Thin Layer Chromatography Sprayer	VWR	KT422530-0010
100 x 15 mm Petri plates	VWR	89038-970
100-1000 µL pipette tips	VWR	76322-164
100-1000 µL single channel pipette	VWR	76169-240
15 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-918
1 L glass bottle	Millipore Sigma	CLS13951L	Must be autoclave safe
1 mL sterile syringe with needle	Thomas Scientific	8935L75	Detachable needle is recommended
2 mL Microcentrifuge tube	VWR	87003-298
50 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-940
5 mL pipette tips	VWR	CA11020-008
7 mL scintilation vials	VWR	76538-962
95% ethanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500
Autoclave	Cole-Parmer	UZ-01850-34	8 L, 115 VAC
Bacteriological agar	VWR	97064-336
bin	Thomas Scientific	1216H91
D-Glucose	VWR	BDH9230-500G
Dichloromethane ≥99.8% ACS	VWR	BDH1113-4LG
Ethyl Acetate ≥99.8% ACS	VWR	BDH1123-4LG
Filter paper	VWR	CA28297-846
Grinding Beads	VWR	12621-148
Hygromycin B	VWR	CA80501-074
Iron Sulfate Heptahydrate	VWR	97061-542
Laminar flow hood	CleanTech	1000-6-A
LC-MS	Waters	LITR10064178	UPLC/MS/MS TQD system
Lyophilizer	Labconco	700201000	Temperature collector -50 °C
Manganese Sulfate Hydrate	VWR	CAAA10807-14
Methanol ≥99.8% ACS	VWR	BDH2018-5GLP
Paper towel	VWR	89402-824
Potato Dextrose Agar	VWR	CA90000-758
Potato Dextrose Broth	VWR	CA90003-494
Potsasium Phosphate Dibasic	VWR	470302-246
Potsasium Phosphate Monobasic	VWR	470302-252
Pressure Gauge 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi)	Tameson	F25U6
Pseudomonas F Agar	VWR	90003-352	Also known as Flo Agar
PTFE Tubing	Sigma Aldrich	58697-U	1/16 inch inner diameter
Sodium Chloride	VWR	BDH9286-500G
Spatula	VWR	82027-490
Sterile Inoculation loops with needle	VWR	76534-512
Tinfoil	Thomas Scientific	1086F24	Can be purchased from supermarket
TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Glass Plates 20 X 20 cm	Thomas Scientific	1205Q12
Vacuum Pump	Labconco	1472100	98 L/min
Vortex	VWR	76549-928	Must accomadate 15 mL and 50 mL centrifuge tubes
Whatman in-line HEPA-VENT	Millipore Sigma	WHA67235000	10 filters, 1/4 to 3/8 inch inlet/outlet
	VWR	97063-370

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Gauthier, L., Wagner, B. D., Boyetchko, S., Kirby, C. W. Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography. J. Vis. Exp. (209), e66967, doi:10.3791/66967 (2024).