薄層クロマトグラフィーによるバイオコントロールのための天然物のバイオアッセイガイド下同定-ダイレクトバイオオートグラフィー

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。 1. 微生物バイオコントロール候補の選定 コンペティションプレートアッセイを使用して、目的の病原体に対して拮抗作用を示す微生物分離株を選択します。注:このプロトコルを実証するために、S. sclerotiorumに対して拮抗作用を示した9つのBacillus分離株が選択されました。これには、Bacillus atrophaeus、mojavensis、およびsubtilis種が含まれます。 2. 培地の準備 ジャガイモデキストロース寒天(PDA)を、水1リットルあたり39gの培地を溶解して調製します。 水1リットルあたり45gの培地を加えて、シュードモナスF寒天培地を調製します。 24 gの培地と水1リットルあたり0.24 gの寒天を加えて、1%寒天でジャガイモデキストロースブロス(PDB)を準備します。 酵母-グルコース-マンガン(YGM)ブロスを準備します。100mLの水に2.5gのKH2PO4と2.5gのK2HPO4からなる緩衝液と、0.58gのMnSO4からなる塩溶液を作成します。H20、0.5 gのNaClおよび0.05 gのFeSO4.7H 20を100 mLの水に。次に、酵母抽出物1g、デキストロース1.25g、水400mL、緩衝液5mL、塩溶液5mL、水90mLを加えて、金属塩が溶液中に沈殿しないようにします。 培地をオートクレーブ滅菌し、寒天を100 x 15 mmのペトリプレートに注ぎ、室温まで冷ましてから使用します。 3.病原体の準備 Sclerotinia sclerotiorumの5プレートをPDA(ステップ2.1で調製)で培養し、25°Cで3日間インキュベートします。 4.天然物抽出物の準備 各細菌分離株をPseudomonas F Agar(ステップ2.2で調製)で培養し、個々のコロニーが観察されるまで増殖します。 単一細菌コロニーを遠心分離機または培養チューブで25 mLのYGM培地に継代培養し、3日間振とうしながらインキュベートします。 各抽出物の5 mLのアリコートを1 LのYGMに移し、同じ条件でさらに3日間インキュベートします。 各培養物を3000 x g で15分間、25°Cで遠心分離し、細胞をペレット化します。 上清をデカントし、酢酸エチルで3回洗浄して、培地から代謝物を抽出します。 それぞれの酢酸エチル層をロータリーエバポレーションで組み合わせて乾燥させます。 抽出物を最小限のメタノールに再溶解し、小さなシンチレーションバイアルに移し、ロータリーエポベーションによって再度乾燥させます。注:抽出物が乾燥して油性または樹脂性の材料になる場合は、材料を凍結乾燥して、正確に計量できる乾燥粉末を得てください。 5. TLCプレートの準備 20cm×20cmのTLCプレートは、プレートの下から2cm、上から2cmのところに線を引いて準備します。一番下の行に、2cm間隔で9つのドットを配置します。一番上の線の上に、4つのドットを4cm離して配置します。 各抽出物5 mgを15 μLのメタノールに溶解し、ピペットを使用して、下部の行にマークされた9つのドットに各抽出物5 μLを塗布します。各抽出物をTLCプレート上でスポット乾燥させ、同じスポットにさらに5μLのアリコートを塗布します。すべての材料がTLCプレートにロードされるまで繰り返します。 ジクロロメタンとメタノールの1:2溶液を使用して、液溶媒がプレートの上部から2cmの線に達するまで(約45分)、現像タンクでTLCプレートを現像します。 開発が完了したら、TLCプレートを取り外し、溶媒ラインの上にマークされた4つのドットに一連のポジティブコントロールを適用します。同じコントロールの4つの濃度が使用されます。 S. scl.の場合、 0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL、および500 μg/mLのハイグロマイシンBがポジティブコントロールです。 プレートからすべての溶媒が蒸発する前に、エタノール滅菌したTLCプレートボックスに入れます。 6. ダイレクトバイオオートグラフィーアッセイ アッセイで使用する材料(クロマトグラフィー噴霧器のガラス部品、金属ヘラ、ペーパータオル4枚、セルロースまたはフィルターペーパー、水、メディア)を、ティンフォイルで覆われた大きなビーカーでオートクレーブします。注:紙の材料(ペーパータオル、セルロース紙)は、オートクレーブで濡れないように錫箔で包む必要があります。 エタノール滅菌PTFEチューブを使用して、空気源、圧力計、クロマトグラフィー噴霧器を接続します。クロマトグラフィー噴霧器と圧力計の間にHEPAフィルターを接続します。 滅菌金属ヘラを使用して5つの病原体プレートの菌糸体マットを滅菌スパチュラを使用して50mLの遠心分離チューブに収集します。注:必要に応じて、菌糸体を取り除くために少量の液体ブロスを使用し、滅菌ピペットで移します。 寒天と滅菌ガラスビーズで修正した25 mLのPDBを50 mLの遠心分離チューブに加え、5分間ボルテックスして菌糸体マットを破砕します。 菌糸体懸濁液を針先付きの滅菌シリンジを使用してクロマトグラフィー噴霧器に移し、大きな菌糸体がクロマトグラフィー噴霧器を詰まらせないようにします。 以前に開発したTLCプレートを層流フードの滅菌ペーパータオルに置き、メディア懸濁液を塗布しながらプレートとの手の接触を減らします。 空気圧を約4バールに上げ、サスペンションをTLCプレートに3回塗布して、塗布の合間にプレートを完全に乾燥させます。注:3つの層が最適な量であることがわかりました。これより少ないと、病原体は成長するための十分な培地を持っていません。それ以上に、培地が厚すぎるため、病原体が活性代謝物と接触できない場合があります。 滅菌したプラスチックプレートボックスに滅菌水500mLを入れ、滅菌した折り畳みセルロースシートまたは濾紙を両側に置き、水分を保持します。 完成したアッセイプレートを、箱の中の4つの空のシャーレに置きます。 アッセイを3日間から1週間、または菌糸体の均一な層がポジティブコントロールと阻害ゾーン(ZOI)の周囲を除いてTLCプレート全体に均一に成長するまでインキュベートします。 7. 液体クロマトグラフィー質量分析 写真を使用して、完成したアッセイを画像化します。 下部のラインからZOIまでの距離を下部のラインから上部のラインまでの距離で割ることにより、各抑制ゾーンの保持係数を計算します。 シリカを阻害ゾーンからこすり落とし、微量遠心チューブに入れます。 各チューブとボルテックスに500μLのメタノールを加えて、シリカから代謝物を抽出します。 8,500 x g 、20°Cで10分間遠心分離し、上清を小さなバイアルに移します。 ロータリーエポベーションまたは窒素の流れの下で蒸発して乾燥させます。 抽出物をLCバイアル中の50 μLのメタノールに再懸濁します。 LC-MSによる阻害ゾーンの代謝物を分析し、それらを粗抽出物中の代謝物と比較して、粗抽出物中のどの代謝物が病原体の阻害に関与しているかを決定します16。 発生源微生物の属と種、およびZOIで同定された質量を用いて、AntibaseやDictionary of Natural Productsなどの文献や関連データベースを検索し、代謝物を特定します。