Estrazione continua liquido-liquido di acidi grassi a catena media dal brodo di fermentazione mediante membrane a fibra cava
Summary
È stato sviluppato un sistema di estrazione liquido-liquido (LLE) che coinvolge membrane a fibre cave per estrarre in modo continuo e selettivo gli acidi grassi a catena media (MCFA) dal brodo di fermentazione. Il sistema LLE raggiunge elevate specificità MCFA da brodi contenenti acidi grassi a catena corta e alcoli. Inoltre, gli MCFA sono concentrati in una soluzione di strippaggio per facilitare il recupero del prodotto.
Abstract
Gli acidi grassi a catena media (MCFA; lunghezze di carbonio: C6-C12) sono sostanze chimiche di alto valore che servono una varietà di applicazioni industriali, tra cui antimicrobici verdi, ingredienti alimentari, additivi per mangimi animali, cosmetici, profumi, prodotti farmaceutici e lipidi strutturati. Attualmente, la maggior parte degli MCFA sono prodotti da olio di palma e di cocco originario del sud-est asiatico e del Sud America. L’approccio convenzionale alla raccolta dei frutti di palma e cocco provoca notevoli danni ecologici in queste regioni. Pertanto, i ricercatori stanno sviluppando approcci biologici (ad esempio, fermentazioni di precisione e in coltura aperta) per generare MCFA in modo più sostenibile utilizzando substrati di basso valore (ad esempio, metanolo, etanolo, lattato) o rifiuti organici come materia prima. L’allungamento della catena microbica (CE) è una piattaforma di fermentazione a coltura aperta a rapida maturazione che converte gli acidi grassi a catena corta (SCFA; lunghezze di carbonio: C1-C5) in un sottoinsieme di questi MCFA a tassi rilevanti a livello industriale. Tuttavia, l’estrazione continua in situ dei prodotti MCFA è necessaria non solo per evitare l’inibizione del prodotto, ma anche per facilitare il recupero degli MCFA in forma pura e utilizzabile. L’estrazione liquido-liquido (LLE) utilizzando membrane a fibre cave e miscele di estratti mirate ha dimostrato un approccio robusto per estrarre selettivamente i prodotti MCFA da brodi di fermentazione contenenti SCFA. Qui, l’applicazione di LLE per la rimozione continua dell’MCFA è dimostrata utilizzando CE come sistema di fermentazione di riferimento e il 3% (p/v) di ossido di triottilfosfina in olio minerale come sistema estrattore. Gli acidi grassi che vanno dall’acido valerico (C5) all’acido caprilico (C8) vengono rimossi selettivamente dai brodi contenenti SCFA e concentrati ad alti titoli in una soluzione alcalina semi-batch per la lavorazione a valle.
Introduction
Gli acidi grassi a catena media (MCFA) sono sostanze chimiche di alto valore che comprendono lunghezze di catena che vanno da sei (C6) a dodici (C12) atomi di carbonio. Gli MCFA hanno applicazioni industriali negli alimenti, nei mangimi per animali, nei prodotti farmaceutici, nei cosmetici, nelle fragranze, negli agenti antimicrobici e nella sintesi chimica 1,2,3. Attualmente, la maggior parte degli MCFA deriva da olio di palma e di cocco proveniente dal sud-est asiatico e dal Sud America 4,5. Il grave danno ecologico associato alla produzione di olio di palma e di cocco è ben riconosciuto dalle parti interessate e dal pubblico in generale. I ricercatori stanno esplorando approcci biologici (ad esempio, fermentazioni di precisione e in coltura aperta) per generare MCFA in modo più sostenibile utilizzando substrati di basso valore o rifiuti organici come materia prima 6,7. Un modo sostenibile per produrre MCFA è l’upcycling dei flussi di rifiuti organici utilizzando un processo chiamato allungamento della catena microbica (CE). Questo bioprocesso di fermentazione secondaria è simile alla digestione anaerobica in quanto sfrutta la versatilità dei microbiomi anaerobici a coltura aperta, ma invece di promuovere la formazione di metano, i sistemi CE sopprimono deliberatamente la via metanogenica. In un microbioma in cui il carbonio non può essere ridotto al massimo a CH4, né l’H2 mantenuto al di sotto di 10-4 atm dagli archaea che consumano idrogeno, la reazione di ossidazione β che normalmente scomporrebbe i carbossilati a catena più lunghi in acetato (ad esempio, C6 → C4 → C2) può essere invertita (ad esempio, C2 → C4 → C6, ecc.), purché un composto ridotto (ad esempio, donatore di elettroni) come etanolo o lattato8. In questo metabolismo, la molecola di acido grasso che subisce l’allungamento funge da accettore di elettroni. Pertanto, invece di generare un prodotto con una lunghezza di carbonio di uno (CH4) come nella digestione anaerobica, il processo CE genera MCFA con lunghezze di carbonio comprese tra sei e otto. Un mercato ampio e in crescita è pronto a ricevere queste piattaforme chimiche ecologiche. Tuttavia, finora, il processo CE non ha dimostrato di produrre MCFA con lunghezze di carbonio superiori a otto atomi di carbonio a tassi apprezzabili.
L’estrazione efficiente di questi MCFA è importante non solo per il recupero del prodotto desiderato, ma anche per prevenire l’inibizione del prodotto e spingere il microbioma verso la produzione di più MCFA1. All’aumentare della concentrazione di MCFA, il metabolismo dell’MCFA viene inibito e diventa meno termodinamicamente favorevole. Rimuovendo continuamente gli MCFA, i tassi di produzione vengono mantenuti. Inoltre, poiché gli SCFA fungono da sottostrutture per il processo di allungamento della catena, non devono essere rimossi dal brodo di fermentazione. Le miscele di estratti mirate dovrebbero estrarre selettivamente i prodotti MCFA dai brodi di fermentazione contenenti SCFA.
In questo caso, viene dimostrato un approccio robusto e pratico per estrarre continuamente MCFA dal brodo di fermentazione contenente SCFA utilizzando un sistema di estrazione liquido-liquido (LLE) comprendente un estrattore idrofobo a membrana a fibra cava in polipropilene, una soluzione di estratto organico selettivo (ossido di triottilfosfina [TOPO]9,10,11) e un estrattore a membrana a fibra cava all’indietro. A monte del sistema LLE è installato un filtro di protezione delle celle per trattenere la biomassa e mitigare le incrostazioni della membrana. Gli MCFA vengono estratti in avanti, nella loro forma protonata, dal brodo di fermentazione acquoso (tipicamente con un set point di pH <5,8) in una soluzione di estratto organico (cioè 3% TOPO (p/v) in olio minerale) e quindi estratti all'indietro in una soluzione di stripping alcalino (pH = 9), dove depronano e si concentrano a titoli elevati per la lavorazione a valle. I particolari set point di pH sono essenziali perché determinano il gradiente di concentrazione tra ogni fase del processo LLE, garantendo un trasferimento netto di MCFA dal brodo di fermentazione alla soluzione di stripping. LLE che utilizza membrane di estrazione in avanti e all'indietro raggiunge alti tassi di estrazione riducendo al minimo la co-estrazione di alcoli e SCFA. L'adiuvante a solvente organico, TOPO, consente la formazione di complessi MCFA. Questi complessi sono più solubili nelle fasi organiche rispetto all'acqua, con conseguente elevata selettività MCFA. Il processo LLE evita anche i numerosi svantaggi associati agli approcci esistenti, che saranno discussi nella sezione Discussione. L'implementazione a lungo termine utilizzando questo approccio LLE è stata dimostrata in diversi studi 9,10,11. Sebbene questo approccio sia particolarmente adatto per applicazioni che coinvolgono la produzione di MCFA tramite l’allungamento della catena microbica, è utile anche in altre applicazioni che richiedono la separazione selettiva di composti con proprietà chimiche simili perché il sistema di estrazione organica può essere personalizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli MCFA prodotti biologicamente si trovano comunemente in miscele insieme a vari composti organici, tra cui SCFA e alcoli2. Di conseguenza, è necessario un processo di separazione selettiva per recuperarli e utilizzarli in modo efficace. Il sistema LLE qui sviluppato estrae selettivamente gli MCFA da queste miscele in modo continuo, conservando SCFA e alcoli. Questa funzionalità rende il sistema LLE particolarmente adatto per applicazioni di fermentazione, come l’allungamento della catena microbica, dove MCFA, SCFA e alcoli costituiscono i metaboliti primari8. In particolare, il sistema LLE consente al processo di allungamento della catena di procedere rimuovendo gli MCFA, impedendo l’inibizione del prodotto1, lasciando gli SCFA e i reagenti alcolici nel brodo di fermentazione per la successiva conversione biologica. Il sistema LLE può essere personalizzato per altre applicazioni modificando la specifica soluzione di estrazione. Ad esempio, l’estrazione continua degli SCFA prodotti durante la fermentazione potrebbe essere ottenuta utilizzando lo stesso sistema LLE rimuovendo il TOPO dalla miscela di soluzione di estrattore.
Pertanto, l’importanza del metodo LLE risiede nel fornire una tecnica di estrazione MCFA più robusta per queste applicazioni di bioprocesso e biotecnologia rispetto ad altri metodi. L’estrazione bifasica in situ con liquidi non miscibili è un altro approccio all’estrazione di MCFA dal brodo di fermentazione15. Tuttavia, questo approccio è relativamente inefficiente. Tra la fase acquosa (cioè il brodo di fermentazione) e la fase organica si formano strati di emulsione, limitando fortemente le velocità di trasferimento di massa. La minima miscelazione del fluido interfacciale tra gli strati di fase limita anche il trasferimento di massa. Un altro svantaggio è che le cellule microbiche sono a diretto contatto con la fase organica, causando trascinamento, inibizione e morte cellulare15. Infine, l’estrazione bifasica in situ richiede una manutenzione frequente per rimuovere e sostituire la fase organica.
L’applicazione di alti tassi di diluizione all’interno del bioreattore è un altro metodo per evitare l’inibizione del prodotto16. Alti tassi di diluizione possono raggiungere un’elevata produttività mantenendo alte concentrazioni di reagenti nel bioreattore. Tuttavia, questo approccio è svantaggioso perché contribuisce al dilavamento della biomassa, alla generazione di grandi volumi di effluenti e alle elevate perdite di substrato (ad esempio, SCFA e alcoli), con conseguenti basse rese. Questi svantaggi possono essere mitigati utilizzando la biomassa immobilizzata e il riciclaggio degli effluenti, ma questi interventi si aggiungono alla complessità del sistema17. Infine, la concentrazione di MCFA nel flusso di prodotti è diluita, rendendo l’MCFA inefficiente e costoso.
Un nuovo approccio di estrazione potrebbe comportare la distillazione continua degli MCFA con un’unica membrana di estrazione diretta che separa fisicamente la fase organica e quella acquosa, trattenendo e proteggendo così la biomassa microbica. Gli MCFA verrebbero estratti selettivamente nella fase organica e quindi distillati. Il raffinato potrebbe essere continuamente riciclato nella membrana di estrazione. La distillazione continua, tuttavia, è tecnicamente impegnativa, soprattutto in laboratorio, e può causare il deterioramento o la perdita dell’estrattore chimico durante il funzionamento a lungo termine. La distillazione può anche causare la degradazione termica della fase organica e dei prodotti MCFA18.
Il processo LLE evita molti degli svantaggi associati a questi approcci alternativi incorporando diverse caratteristiche critiche e fasi di elaborazione. In primo luogo, il filtro a membrana idrofila a fibra cava ha il duplice scopo di proteggere le cellule della biomassa (i biocatalizzatori) dall’esposizione alla soluzione estrattore nel FEB, fornendo al contempo un filtrato chiaro ricco di MCFA che riduce le incrostazioni e l’accumulo di solidi nel sistema LLE. In secondo luogo, per evitare il cross-over del liquido, abbiamo incorporato valvole a spillo per creare una contropressione sul lato del tubo di ciascun contattore a membrana. Questa precauzione mantiene un leggero gradiente di pressione transmembrana, impedendo la fuoriuscita indesiderata del solvente organico idrofobo dal lato del guscio al lato acquoso del tubo nel FEM e nel BEM. Inoltre, i flussi di liquido sono configurati per fluire in parallelo dalla base alla sommità del FEM e del BEM per evitare l’intrappolamento di bolle di gas che potrebbero accumularsi all’interno dei moduli a membrana, riducendo l’efficienza di trasferimento e causando il carry-over. Inoltre, questo metodo utilizza una pompa a membrana con una testa pompante in PTFE chimicamente resistente per pompare la soluzione estrattore corrosiva contenente MCFA, salvaguardando il sistema dalla corrosione e dai guasti che potrebbero compromettere il processo di estrazione. Infine, la soluzione di stripping alcalino a pH controllato mantiene un gradiente di pH che consente il trasferimento continuo di MCFA attraverso il sistema LLE ad alte velocità dal bioreattore al serbatoio della soluzione di stripping, dove gli MCFA si deprotonano e si accumulano ad alti titoli, facilitando il recupero del prodotto a valle.
Questo metodo LLE è appropriato per l’estrazione continua di MCFA da bioreattori su scala di laboratorio (fino a un volume di lavoro di 6 L) ed è stato convalidato per il funzionamento a lungo termine in diversi studi 1,9,11,19. Il metodo LLE può essere applicato anche per applicazioni su larga scala14 (ad esempio, bioreattori su scala pilota), ma richiede membrane e apparecchiature per la movimentazione dei fluidi su scala proporzionale. Tuttavia, il metodo presenta alcune limitazioni, principalmente nell’area della manutenzione e della complessità del sistema. Poiché il processo è progettato per funzionare in modo continuo, i moduli a membrana e le pompe devono essere sottoposti a manutenzione frequentemente, con conseguenti notevoli tempi di fermo. Un altro svantaggio è che la soluzione di strippaggio richiede quantità relativamente grandi di NaOH e acido borico. Inoltre, gli MCFA sono corrosivi e causano il deterioramento di alcuni componenti del sistema LLE nel tempo. Ad esempio, i connettori in plastica e l’alloggiamento della membrana possono diventare fragili, richiedendo la sostituzione durante il funzionamento. Infine, la rete di movimentazione dei fluidi nel sistema LLE è complessa e coinvolge molti punti di connessione che possono sviluppare perdite. La maggior parte di queste limitazioni e inconvenienti, tuttavia, sono tipici dei processi di separazione continua a membrana e dovrebbero essere previsti.
Nel complesso, questo protocollo LLE offre un approccio robusto ed efficiente per l’estrazione selettiva di MCFA, che ha implicazioni per l’avanzamento della ricerca in diversi campi. Il metodo potrebbe trovare molte applicazioni rilevanti nel campo della fermentazione di precisione per il recupero in situ di prodotti metaboliti extracellulari durante la fermentazione. L’LLE potrebbe essere un’alternativa a basso costo agli approcci convenzionali di lavorazione a valle (DSP), come la centrifugazione post-corsa, la micro e ultrafiltrazione o le estrazioni con solvente eseguite in lotti. In effetti, la DSP rappresenta spesso un importante fattore di costo nei processi di fermentazione industriale. L’estrazione continua del prodotto mediante LLE può anche consentire fermentazioni continue, migliorando notevolmente la produttività delle operazioni e l’efficienza in termini di esecuzione rispetto agli approcci batch convenzionali o alimentati. Inoltre, la ricerca futura potrebbe studiare mezzi di estrazione diversi dai solventi organici, come i solventi eutettici profondi o i liquidi ionici. Infine, il sistema LLE descritto in questo protocollo era destinato a scopi sperimentali in un ambiente di laboratorio; Pertanto, c’è ancora un notevole spazio per studi di ottimizzazione per ridurre il fabbisogno energetico, l’area della membrana e le rese e i tassi di estrazione complessivi.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il supporto tecnico e finanziario fornito dalla Stazione Sperimentale Agricola dell’Università della Georgia. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Samuel Ogundipe, il Dr. Ronald Pegg e il Dr. Joon Hyuk Suh per il loro aiuto nell’analisi dei campioni di processo.
Materials
| 10 L Media Bottle | Duran | 218018658 | |
| 3.5 L Media Bottle | Duran | 218016957 | |
| Boric acid, 99.5%, | ThermoScientific (Fisher Scientific) | 327132500 | |
| Hydrophilic MINIKROS 20CM 0.2UM PES 1MM 1.5TC X 3/4TC | Repligen | N02-P20U-10-N | |
| L/S Variable-Speed Pump Drive; 100 rpm | MasterFlex (VWR) | MFLX07528-10 | |
| L/S Variable-Speed Pump Drive; 300 rpm | MasterFlex (VWR) | MFLX07528-20 | |
| Light Mineral Oil, NF (4 Liters) (CAS: 8042-47-5) | Thomas Scientific | C761Z18 | |
| Liqui-Cel 2.5×8 X50 membrane CO2, PP Housing Viton O-rings (0.5-3 gpm (0.1-0.7 m3/h)), 1/4-in FNPT connections | 3M | LC-02508X50-G453 | |
| Magnetic Stirrer, 20 L Capacity, 110 V | Cole-Parmer | EW-04661-29 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 14 | MasterFlex (VWR) | MFLX06402-14 | Specific tubing size will depend on application. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 16 | MasterFlex (VWR) | MFLX06402-16 | Specific tubing size will depend on application. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 17 | MasterFlex (VWR) | MFLX06402-17 | Specific tubing size will depend on application. |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Tygon, Size 18 | MasterFlex (VWR) | MFLX06402-18 | Specific tubing size will depend on application. |
| MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 14, Polycarbonate Housing, CRS Rotor | MasterFlex (VWR) | MFLX07014-20 | Specific pump head size will depend on application. |
| MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 14, Polycarbonate Housing, CRS Rotor | MasterFlex (VWR) | MFLX07014-20 | Specific pump head size will depend on application. |
| MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 16, Polycarbonate Housing, CRS Rotor | MasterFlex (VWR) | MFLX07016-20 | Specific pump head size will depend on application. |
| MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 17, Polycarbonate Housing, CRS Rotor | MasterFlex (VWR) | MFLX07017-20 | Specific pump head size will depend on application. |
| MasterFlex L/S Standard Pump Head for Precision Tubing L/S 18, Polycarbonate Housing, CRS Rotor | MasterFlex (VWR) | MFLX07018-20 | Specific pump head size will depend on application. |
| MasterFlex PTFE-diaphragm pump head, 10 to 100 mL/min | MasterFlex (VWR) | MFLX07090-62 | |
| Oakton 220 pH/ORP/Temperature Controller, 1/8 DIN | Spectrum Laboratory Products | 664-12595-E1 | |
| Oakton 220 pH/ORP/Temperature Controller, 1/8 DIN | Spectrum Laboratory Products | 664-12595-E1 | |
| Oakton Female BNC-to-Stripped Wire Adapter | Spectrum Laboratory Products | 664-12592-E1 | |
| pH Probe with BNC Connector | ThermoScientific | 10010-788 | Any pH probe with a BNC connector will suffice. |
| Precision Flow-Adjustment Valve, White Polypropylene, 1/4 NPT Male x Male | McMaster-Carr | 7792K57 | |
| ProConnex Fittings Kits – A | Repligen | ACPX-KT2-01N | Compatible with Hydrophilic MINIKROS Filter |
| ProConnex Fittings Kits – B | Repligen | ACPX-KT1-01N | Compatible with Hydrophilic MINIKROS Filter |
| Sodium Hydroxide Pellets for Analysis | Sigma Aldrich | 1.06498 | |
| Stainless-Steel Pressure Gauge 0-60 psi Stainless Steel 1/4" NPT 2.5" Face Dial | NA | XJ-219 | Any comparable pressure gauge covering 0-60 psig range will suffice. |
| Trioctylphosphine oxide (TOPO) | Sigma-Aldrich | 346187-100G |
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