Summary

Optimierung der Tränensammlung bei Mäusen für die mRNA- und Proteinanalyse

Published: July 19, 2024
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Summary

Die Identifizierung von RNA- und Protein-Biomarkern aus Rissen in Mausmodellen ist vielversprechend für die Frühdiagnostik verschiedener Krankheiten. Dieses Manuskript bietet ein umfassendes Protokoll zur Optimierung der Wirksamkeit und Effizienz der mRNA- und Proteinisolierung aus Maustränen.

Abstract

Der Tränenfilm ist eine hochdynamische Bioflüssigkeit, die in der Lage ist, pathologische molekulare Veränderungen nicht nur in der Augenoberfläche, sondern auch in anderen Geweben und Organen widerzuspiegeln. Die molekulare Analyse dieser Bioflüssigkeit bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, Krankheiten zu diagnostizieren oder zu überwachen, die Wirksamkeit medizinischer Behandlungen zu beurteilen und mögliche Biomarker zu identifizieren. Aufgrund des begrenzten Probenvolumens erfordert die Entnahme von Tränenproben spezifische Fähigkeiten und geeignete Werkzeuge, um eine hohe Qualität und maximale Effizienz zu gewährleisten. In Humanstudien wurden verschiedene Methoden der Tränenprobenahme beschrieben. In diesem Artikel wird eine umfassende Beschreibung eines optimierten Protokolls vorgestellt, das speziell auf die Extraktion tränenbezogener Proteininformationen aus experimentellen Tiermodellen, insbesondere Mäusen, zugeschnitten ist. Diese Methode umfasst die pharmakologische Stimulation der Tränenproduktion bei 2 Monate alten Mäusen, gefolgt von der Probenentnahme mit Schirmer-Streifen und der Bewertung der Wirksamkeit und Effizienz des Protokolls durch Standardverfahren, SDS-PAGE, qPCR und digitale PCR (dPCR). Dieses Protokoll kann leicht für die Untersuchung der Tränenproteinsignatur in einer Vielzahl von experimentellen Paradigmen angepasst werden. Durch die Etablierung eines erschwinglichen, standardisierten und optimierten Tränenentnahmeprotokolls für Tiermodelle sollte die Lücke zwischen Human- und Tierforschung geschlossen, translationale Studien erleichtert und der Fortschritt auf dem Gebiet der Erforschung von Augen- und systemischen Erkrankungen beschleunigt werden.

Introduction

Tränen gelten als Plasma-Ultrafiltrat und wurden aufgrund einer signifikanten Überlappung der Biomoleküle, die sie teilen, auch als Zwischenflüssigkeit zwischen Plasmaserum und Liquor cerebrospinalis beschrieben1. Es wurde berichtet, dass menschliche Tränen Proteine, Tränenlipide, Metaboliten und Elektrolyte enthalten2. In jüngster Zeit wurden auch andere Biomoleküle wie mRNAs, miRNAs und extrazelluläre Vesikel identifiziert 3,4,5,6,7.

Beim Menschen befinden sich die Basaltränen im Tränenfilm, der aus drei Schichten besteht: der äußeren Lipidschicht, die die Tränenoberfläche glatt hält, damit wir hindurchsehen können und die Verdunstung der Tränen verhindert wird; die mittlere wässrige Schicht, die das Auge mit Feuchtigkeit versorgt, Bakterien abweist, die Hornhaut schützt und 90 % des Tränenfilms ausmacht; Und schließlich die Muzinschicht, eine Familie von Proteinen mit hohem Molekulargewicht, die mit der Hornhaut in Kontakt kommen und es der Träne ermöglichen, am Auge zu haften8. Die Tränenverteilung über die Augenoberfläche beginnt mit der Sekretion aus der Tränendrüse. Diese Flüssigkeit wird dann durch Tränenkanäle geleitet, um über die Augenoberfläche zu fließen und in die Abflusskanäle zu fließen. Mit jedem Blinzeln können sich die Tränen gleichmäßig über das gesamte Auge verteilen und es bleibt feucht9.

Der Tränenfilm ist eine hochdynamische Bioflüssigkeit, die in der Lage ist, molekulare Veränderungen widerzuspiegeln, die nicht nur auf der Augenoberfläche, sondern auch in anderen Geweben und Organen auftreten. Die Analyse der differentiellen Expression in dieser Bioflüssigkeit stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Entdeckung von Biomarkern bei menschlichen Krankheitendar 10,11. Die Verwendung von Tränenfilm als Quelle von Biomarkern für die Früherkennung verschiedener Pathologien wurde durch das Vorhandensein nicht-invasiver Entnahmemethoden erheblich erleichtert. Die gebräuchlichste Methode zum Sammeln von Tränen in Human- und Tierkliniken ist eine membranbasierte Stütze (Schirmer-Streifen), die nach dem Prinzip der Kapillarwirkung funktioniert und es dem Wasser in den Tränen ermöglicht, entlang der Länge eines Papierteststreifens oder von Kapillarröhrchen zu wandern, die in den unteren Bindehautsack des Probanden eingesetzt werden 12,13,14. Trotz der inhärenten Einschränkung, mit dieser Methode ein kleines Probenvolumen zu erhalten, hat die biochemische Analyse der Tränenzusammensetzung unter Verwendung verschiedener empfindlicher Techniken die Identifizierung potenzieller Biomarkermoleküle erleichtert11,15. Protokolle zur Optimierung und Bewertung der Elution von Tränenproteinen aus Schirmer-Streifen und Kapillaren bei menschlichen Patienten sind gut dokumentiert16,17. Vollständige Beschreibungen von optimierten Protokollen, die speziell entwickelt wurden, um molekulare Informationen über Tränen aus experimentellen Tiermodellen zu extrahieren, sind jedoch verfügbar, aber rar. Bestehende Methoden, wie z. B. die Träneninduktion durch direkte Stimulation der Tränendrüse18, ermöglichen zwar die Entnahme größerer Volumina, sind jedoch invasiv und können bei den Tieren zu Beschwerden führen. Nicht-invasive Methoden, wie das Sammeln von Rissen von der Augenoberfläche, wurden als eine Möglichkeit zur Isolierung von DNA und miRNAs beschrieben19,21.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine kostengünstige und optimierte Methode zur Sammlung und Verarbeitung von Tränen bei Mäusen zu etablieren. Die Methode legt den Schwerpunkt auf die Nicht-Invasivität und erhält gleichzeitig ausreichende Tränenvolumen, die für die molekulare Analyse durch Techniken wie SDS-PAGE, qPCR und dPCR geeignet sind. Die Informationen über den extrahierten Protein- und mRNA-Gehalt können dann genutzt werden, um potenzielle Biomarker in bestehenden experimentellen Krankheitsmodellen zu identifizieren.

Protocol

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von der Tierethikkommission von Cinvestav genehmigt (CICUAL, # 0354/23). Die Labortiere wurden in strikter Übereinstimmung mit den Tierverwendungsrichtlinien der Zeitschrift und gemäß der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung behandelt und behandelt. Die Augengesundheit vor und nach den Eingriffen wurde durch die Beurteilung von Augenausfluss, geschwollenen Augenlidern, A…

Representative Results

Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll bietet eine einfache und erschwingliche Methode zur Gewinnung molekularer Informationen aus Tränenflüssigkeit unter Verwendung von Techniken, die in den meisten molekularbiologischen Laboratorien üblicherweise verfügbar sind. Darüber hinaus kann das Protokoll durch den Einsatz hochempfindlicher Techniken wie ELISA zum Nachweis der enzymatischen Aktivität skaliert werden. Nach diesen Verfahren betrug die Gesamtproteinausbeute etwa 3-4 μg/μl. …

Discussion

Tränenflüssigkeit ist leicht zugänglich, und die Bestimmung von Biomarkern in Tränen kann als erfolgreiche ergänzende Technik zur Früherkennung verschiedener menschlicher Krankheiten eingesetzt werden27. Während die biochemische Analyse der Tränenzusammensetzung in experimentellen Tiermodellen diesen Ansatz ergänzt und erhebliche Fortschritte beim Verständnis der molekularen Grundlagen von Krankheiten verspricht, gibt es einen Mangel an verfügbaren Daten und Protokollen, was uns dazu ve…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von der VELUX STIFTUNG [Projekt 1852] an M.L. und Postgraduiertenstipendien von CONAHCYT an M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) und A.M.F. (CVU 1317418). Herzlichen Dank an alle Mitglieder des Laboratoriums, des Centro de Investigación sobre el Envejecimiento und des Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) für ihre Beiträge zu den anregenden Diskussionen.

Materials

2-mercaptoethanol Gibco 1985023
2x Laemmli buffer Bio-Rad 16-0737
Acetic Acid Quimica Meyer 64-19-7
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
Bradford Reagent Sigma-Aldrich B6916
Chloroform Sigma-Aldrich 1003045143
Coomassie Blue R 250 US Biological 6104-59-2
Ethanol Quimica Rique 64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA Ladder Thermofisher scientific SM1331
Glycerol US Biological G8145
Glycine SANTA CRUZ SC- 29096
Glycogen Roche 10901393001
HCl Quimica Rique 7647-01-0
Isopropyl alcohol Quimica Rique 67-63-0
Methanol Quimica Meyer 67-56-1
Micro tubes 1.5 ml Axygen MCT-150-C
Micro tubes 600 µl Axygen MCT-060-C
NaCl Sigma-Aldrich S3014
PCR tubes & strips Novasbio PCR 0104
Pilocarpine Sigma-Aldrich P6503-10g
Protease inhibitor Roche 11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5mL) Qiagen 250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24-well (10) Qiagen 250001
Real qPlus 2x Master Mix Green Ampliqon A323402
RevertAid First Strad cDNA Synthesis Kit Thermofisher scientific K1622
Schirmer's test strips Laboratorio Santgar SANT1553
SDS Sigma-Aldrich L3771
TEMED Sigma aldrich 102560430
TRI reagent Sigma-Aldrich T9424-200ML monophasic solution of phenol and guanidinium isothiocyanate
Tris US Biological T8650
Tris base Chem Cruz sc-3715A

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Diesen Artikel zitieren
Bello, M., Morales-Farfán, A., Martínez-Colín, E. J., Lezama, I., Lamas, M. Optimizing Tear Collection in Mice for mRNA and Protein Analysis. J. Vis. Exp. (209), e66955, doi:10.3791/66955 (2024).

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