Minipigs의 단일 단계 조직 공학 요로상피관에 대한 수술 모델

이 실험은 동물 피험자의 실험실 사용에 관한 유럽 법률에 따라 덴마크 식품 농업부(Ref. no. 2022-15-0201-01206)에서 부여한 윤리적 허가를 받은 AAALAC 인증 실험 시설에서 수행되었습니다. 1. 수술 절차 동물 준비다 자란 암컷 괴팅겐 미니피그를 수술 전 최소 12시간 동안 빠르게 만듭니다. 아래 설명된 대로 모든 멸균 기구가 있는 수술 테이블을 준비합니다. 다 자란 표준 크기 미니피그의 경우, 1.25mL의 케타민(100mg/mL), 6.25mL의 자일라진(20mg/mL), 1.25mL의 메타돈(10mg/mL) 및 2mL의 부토르파놀(10mg/mL)(나중에 진정 혼합물이라고 함)에 현탁된 졸라제팜 125mg과 틸레타민 125mg의 용액과 함께 1.0-1.4mL/10kg으로 근육 주사로 동물을 진정시킵니다. 시각 유도 기관내 삽관을 수행합니다. 활력 징후와 눈 및 디지털 간 반사 검사로 마취를 확인합니다. 안과 연고를 양측으로 바릅니다. 양측 귀 정맥 카테터를 설치하고 프로포폴(10-15mg/kg/h)과 펜타닐(5-15mg/kg/h)로 마취를 유지합니다. 8 Fr 요로 카테터를 삽입하고 적절한 크기의 루어 락 주사기를 사용하여 생리학적으로 온화한 등장성 식염수 250mL를 방광에 채웁니다. 돼지를 앙와위 자세로 놓고 복부를 찢어 문지릅니다. 70% 에탄올로 두 차례 더 피부를 청소한 후 멸균 드레이핑으로 수술 부위를 구성합니다. 조직 채취 및 외과적 골격 이식메스와 소작술을 사용하여 피부, 근육 및 복막을 나누고 복강 내 방광을 상처 쪽으로 당겨 표준 하부 정중선 개복술을 수행합니다. 전방 방광벽에 예방적 지혈을 수행하고 2cm2 전벽 분절을 절제하여1cm2 의 근위 개구부를 남기고 나머지 방광벽을 빠르게 흡수할 수 있는 꼰 러닝 봉합사로 닫습니다. 절제된 검체의 점막층을 조심스럽게 절개하고 2cm2 점막 검체를 1mm2 미세 이식편에 다져 골격 매립을 위해 만듭니다(아래 섹션 2에서 설명). 스캐폴드를 완성한 후, 천천히 흡수할 수 있는 모노필라멘트 러닝 봉합사를 사용하여 전방 방광 벽의 나머지 개구부에 관 구조를 문합합니다. 치골 인대의 복막 플랩을 사용하여 세뇨관 골격을 패치하고 내강 내 14 Fr 전행 결장 관장(ACE) 스토퍼를 세뇨관 골격에 삽입합니다. 소변이 새는 것을 방지하기 위해 천천히 흡수되는 4-0 모노필라멘트 봉합사로 도관의 말단부를 결찰하고 방광 카테터를 통해 주사기로 총 250mL의 멸균 식염수를 주입하여 문합 개통을 확인합니다. 경근막(trans-fascial channel)을 정중선(midline)에서 측면으로, 우측의 꼬리 유선(caudal mammary gland)에서 2-3cm를 둔하게 절개하고, 도관을 피하 포켓에 넣습니다. 원위 도관을 두 개의 경피적 비흡수성 모노필라멘트 봉합사로 고정하여 피부 수준에서 위치를 표시합니다. 천천히 흡수할 수 있는 모노필라멘트 러닝 봉합사로 복부 근육의 전방 근육 근막을 닫고, 빠르게 흡수할 수 있는 꼰 러닝 봉합사로 피하를 조정하고, 비흡수성 모노필라멘트 러닝 봉합사로 피부를 닫습니다. 마취를 중단한 후 동물을 발관하고 완전히 보행할 수 있고 안전하게 마시고 먹을 수 있을 때까지 마구간에서 관찰하십시오. 2. 비계 건설 복합 스캐폴드의 준비수술 전(최대 2시간) 앞서 설명한 대로 쥐꼬리 콜라겐 I형의 액체 용액을 준비합니다17. 간단히 말해서, 콜라겐 용액에 4:1의 10x 최소 필수 매체(MEM)를 추가하고 1M NaOH로 pH를 7.4로 근사화한 다음 마지막으로 1x MEM을 추가하여 최종 콜라겐 농도 1.64mg/mL를 목표로 합니다. 나중에 사용할 때까지 용액을 멸균 바이알에 얼음 위에 보관하십시오. 외과적 조직 절제 및 다진 후에는 겸자를 사용하여 점막 입자(즉, 미세 이식편)를 1:6 팽창률(예: 2cm2 점막 조직이 12cm2 메쉬로 확장됨)로 2cm x 6cm 장착된 생분해성 메쉬에 수동으로 놓습니다. 멸균 강판 위에 1cm x 3cm x 6cm(높이 x 너비 x 길이) 크기의 멸균 직사각형 강철 금형을 준비하고 미세 이식편이 위쪽을 향하도록 메쉬를 강철 금형에 넣습니다. 콜라겐 용액 20mL를 금형에 부드럽게 붓고 메쉬에서 미세 이식편이 씻겨 내려가지 않도록 합니다. 전체 구조물을 38°C 멸균 가열 챔버로 옮기고 5분 동안 응고시킵니다. 충분히 응고시킨 후 구멍이 뚫린 강판 위에 놓인 나일론 메쉬에 하이드로겔을 밀어 넣고 금형을 부드럽게 제거합니다. 겔 위에 나일론 메쉬를 놓고 강판을 올려 하이드로겔에서 수분을 배출한 다음 강판 위에 120g의 무게(이 경우 매립에 사용된 강철 주형에 해당)로 5분 동안 수동적으로 압축합니다. 압박 후, 납작한 지지체를 생분해성 스텐트 주위로 굴리고, 5cm x 0.6cm(길이 x 내경) 크기의 미세 이식편을 스텐트를 향하게 하고, 천천히 흡수되는 모노필라멘트 러닝 봉합사로 골격을 세로로 봉합합니다. 완성된 도관은 이제 외과적 이식 준비가 되었습니다. 3. 수술 후 관리 진통 및 항생제 예방처음 3일 동안은 부프레노르핀(0.05-0.1 mg/kg/8시간 정맥 주사), 처음 4일 동안은 멜록시캠(0.4 mg/kg/일 근육 주사 또는 경구), 트리메토프림(2.7 mg/kg/일 근육 주사 또는 4.2 mg/kg/일 경구) 및 설파독신(13.3 mg/kg/일 근육 주사 또는 20.8 mg/kg/일 경구) 투여합니다. 수술 후 동물이 아직 마취된 상태에서 근육 주사를 투여합니다. 외부 정맥 카테터와 봉합사 재료를 갉아먹는 것을 피하기 위해 동물을 단독으로 사육합니다. 플렉시 유리 창을 통해 이웃 minipigs와 시각적 접촉을 제공하고 펜 사이의 접촉 가능성을 제공합니다. 매일 신선한 짚과 건초, 장난감과 물을 제공하고 매일 두 번 먹이 를 제공합니다. 동물의 자연스러운 행동, 식습관, 소변 및 대변 생성을 매일 모니터링하고 매주 체중을 평가합니다. 관찰 기간(6주)이 끝나면 진정 혼합물의 1-1.4mL/10kg 근육 주사로 동물을 진정시키고 치명적인 펜토바르비탈 주사(100mg/kg 정맥 주사)로 동물을 종결합니다. 4. 사후 평가 총 해부학종단 후 피부 높이에서 원위 도관을 절개하고 ACE 스토퍼를 제거합니다. 플라스틱 클램프로 요도를 닫고 카테터를 사용하여 원위 도관 입구를 통해 등장성 식염수에 아이오헥솔의 1:20 조영제 용액 250mL를 주입합니다. 64슬라이스 컴퓨터 단층 촬영 스캐너로 동물을 평가합니다. 다중 평면 재구성을 사용하여 이미지를 시각화하고 의료 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 모든 이미지를 분석합니다. 본래 요도를 통해 16.2 Fr flexible cystoscope를 사용하여 방광과 도관 lumina의 내시경 검사를 수행합니다. 도관을 절제하면서 총체적인 해부학적 소견을 신중하게 평가합니다. 또한 도관 문합에 2cm 여유를 두고 전체 벽 방광 생검을 절제하고 참조 값에 대해 유사한 방식으로 처리합니다. 조직학적 처리절제된 검체를 24시간 동안 10% 포르말린으로 고정합니다. 메스로 도관을 직각으로 근위부, 내측 및 원위 도관 세그먼트의 동일한 크기의 개별 섹션으로 나눕니다. 증가된 에탄올 농도로 표본을 탈수하고 마이크로톰 절단 전에 파라핀에 삽입합니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 판시토케라틴 CK-AE로 5μm 절편을 염색하고 디지털 조직학 슬라이드 스캐너로 스캔합니다.