Yetişkin farelerde lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla adeno ilişkili virüsün tutarlı bir şekilde verilmesi

Tüm hayvan işleme ve enjeksiyon prosedürleri NINDS’deki Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm hayvan prosedürleri, NINDS hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Enjeksiyon öncesi hazırlık AAV dozunun hazırlanmasıEnjekte edilecek farelerin ortalama ağırlığını belirleyin. Denklem (1)’de gösterildiği gibi kurumun hayvan bakım yönergelerine göre izin verilen maksimum enjeksiyon hacmini hesaplayın. Maksimum enjeksiyon hacmi tipik olarak bir hacim (μL)/fare ağırlığı (g) değeridir (ör., 10 μL/g.).Maksimum enjeksiyon hacmi (μL)/fare= (maksimum enjeksiyon hacmi (μL/g)) × (ortalama fare ağırlığı (g)) (1)NOT: Örnek Hesaplama: Maksimum enjeksiyon hacmi/fare= 10 μL/g × 20 g/fare= 200 μL/fare Fare başına verilecek AAV vektör genom (vg) dozunu ayarlayın.NOT: Bu, farklı fareler arasında aynı mutlak değer olabilir (örneğin, her farenin ağırlığına bakılmaksızın tüm fareler 1,5 ×10 12 vg alır). Veya doz vg / kg cinsinden olabilir, bu nedenle fare başına enjekte edilecek toplam vg, o farenin enjeksiyon günündeki ağırlığına göre her fare için hesaplanmalıdır.Doz vg / kg ise, doz hazırlığından önceki enjeksiyon gününde her fareyi tartın. Denklem (2)’yi kullanarak her fare için ağırlığına göre verilecek vektör genomlarını hesaplayın:Belirli bir farede verilecek vektör genomları (vg) = Önceden belirtilen vg/kg değeri (vg/kg) × (2)NOT: Enjekte edilen dozlar arasında geçerli karşılaştırmalar sağlamak için bazı preklinik çalışmalarda doz birimi olarak vg / fare yerine vg / kg kullanmak daha uygun olabilir. Bu, aynı yaştaki erkek ve dişi fareler arasındaki veya muhtemelen aynı cinsiyetteki fareler arasındaki ağırlık farklılıklarından kaynaklanmaktadır. Gerekli dozu hazırlamak için gerekli olan stok AAV ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) hacimlerini hesaplamak için maksimum enjeksiyon hacmini ve AAV (vg) dozunu kullanın (bkz. denklem (3-6)). Enjekte edilecek hacmin izin verilen maksimum enjeksiyon hacmine eşit veya daha az olduğundan emin olun. Pipetleme hatalarını ve şırınganın ölü alanını hesaba katmak için her zaman enjekte edilecek hacimden en az 15 μL daha büyük bir enjeksiyon hacmi hazırlayın.Enjekte konsantrasyonu (vg/μL) = (3)Enjeksiyonu hazırlamak için eklenecek toplam AAV vektör genomları (vg) = Enjekte konsantrasyonu (vg/μL) × hazırlanacak hacim (μL) (4)Enjeksiyonu hazırlamak için eklenecek AAV stoğunun hacmi) (μL) = (5)Enjeksiyonu hazırlamak için eklenecek PBS hacmi (μL) = Hazırlanacak hacim (μL) – Enjeksiyonu hazırlamak için eklenecek AAV stoğunun hacmi (μL) (6)NOT: Örnek hesaplama:6 ×10 13 vg/kg (doz), 25 g ağırlığındaki bir farede 200 μL/fare (enjekte edilecek hacim) olarak verilecektir. AAV stok titresi 3.0 ×10 13’tür (vg/mL)Bu özel farede verilecek vektör genomları (vg) = 6 × 1013 (vg/kg) × = 1.5 × 1012 vg bu fare içinEnjekte konsantrasyonu= = 7.5 × 109 (vg / μL)Enjeksiyonu hazırlamak için eklenecek toplam AAV vektör genomları = 7.5 × 109 (vg/μL) × (200 (μL) + 15 (μL)) = 1.6125 × 1012 (vg)Enjeksiyonu hazırlamak için eklenecek AAV stoğunun hacmi = = 53.75 (μL)Enjeksiyonu hazırlamak için eklenecek PBS hacmi = 215 (μL) – 53.75 (μL) = 161.25 (μL) AAV doz hazırlama prosedürüNOT: Otoklavlanmış steril RNaz içermeyen ve DNaz içermeyen 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünde AAV’nin işlenmesi için kurumun biyogüvenlik ve KKD yönergelerini izleyerek, AAV enjeksiyonunu adım 1.1.3.3’teki hesaplamalara göre AAV stoğu ve steril PBS kullanarak hazırlayın. Stok AAV ve AAV enjeksiyonunu her zaman buz üzerinde tutun. Steriliteyi sağlamak için temiz mikropipetler ve yeni mikropipet ucu kutuları kullanın. AAV ile kirlenmiş mikropipet uçlarını kurumun atık yönetimi yönergelerine göre atın.Stok AAV’yi buz üzerinde çözün.NOT: AAV stoğunu çözdürmekten ve yeniden dondurmaktan kaçının. Yeniden dondurulması gereken doz hazırlığından sonra fazla AAV olmasını önlemek için AAV stoğunu 100-200 μL’lik alikotlar halinde sipariş edin veya hazırlayın. Enjeksiyon istasyonu hazırlığıTemizlemeÇalışma alanını etanol (EtOH) ile temizleyin. Çalışma alanını bakteri yok edici, mantar öldürücü ve virüsidal reaktif(ler) kullanarak dezenfekte edin. Fare tüpü tutucusunu su ve sabunla temizleyin. İstasyon araçlarının kurulumuTemiz, boş 15 mL’lik bir konik tüpü bir tüp tutucusuna/rafına yerleştirin. Fare tüpü sınırlayıcısının yerleştirileceği yükseltilmiş bir platform kurun (Şekil 1A,B). Temiz fare tüpü tutucusunu çalışma alanına yerleştirin. Mevcut fare tüpü süzgecinden çok daha küçük fareler enjekte ediyorsanız, bir kısıtlama manşonu yapmak için plastik bir kemirgen tutucu koni kullanın. 2.1.3-4 adımlarına bakın. Enjeksiyonlar için kullanılacak şırıngaları çalışma alanına yerleştirin. 29 G iğneli 0,3 mL insülin şırıngaları kullanın. AAV ile kontamine olmuş aletlerin hemen atılmasını sağlamak için atık kabını enjeksiyon istasyonuna mümkün olduğunca yakın yerleştirin. Pistonun düzgün hareket ettiğinden emin olmak için her bir şırınganın pistonunu birkaç kez çekin ve itin, böylece enjeksiyon sırasında şırınganın neden olduğu bir direnç olmaz. Piston düzgün hareket etmezse, bu şırıngayı atın ve yenisiyle değiştirin. Enjeksiyon alanının yanında bir fare ölçeği ve mini santrifüj bulundurun. Hazırlanan AAV’yi enjeksiyon alanında buz üzerinde hazır bulundurun. Ilık su hazırlayın (38-40 °C). Fare kuyruğunda yanıklara neden olmamak için su sıcaklığının 40 °C’yi geçmemesine dikkat edin. 2. Enjeksiyon prosedürü Fare kısıtlamaGerekirse dozu vg / kg cinsinden hesaplamak için her fareyi tartın. Farenin tamamen kısıtlandığından ve hareket edemediğinden emin olun.NOT: Fare tam olarak kısıtlanmazsa, IV uygulaması sırasında hareket edebilir ve bu da iğnenin yer değiştirmesine neden olabilir. Bu, iğnenin damardan çıkmasına ve/veya farenin yaralanmasına neden olabilir. Tüp süzgeci için:Tutucuyu temizlemek ve ısıtmak için tutucuyu fareler arasında ılık su ve sabunla yıkayın. Fareyi kuyruğundan tutun. Farenin kuyruğunu tüpün üst açıklığına sokun; Ardından, fareyi yavaşça tüp tutucuya çekin. Tüp tutucunun boyutu farenin boyutuna uygunsa, farenin kaçmasını önlemek için fişi farenin önüne yerleştirin.NOT: Farenin tüpün içinde hareket etmesini veya dönmesini önlemek için fiş fareye yeterince yakın olmalıdır, ancak fiş, farenin serbestçe nefes almasını sağlamak için farenin burnunu engellememelidir. Fare, tüp tutucu boyutundan daha küçükse, aşağıda adım 2.1.4’te açıklandığı gibi tüp tutucuya ek olarak esnek bir tek kullanımlık tutucu koni kullanın. Gerekirse esnek tek kullanımlık tutucu koniler için (daha küçük fareler için bir sınırlama kılıfı yapmak için):Farenin burnunun tıkalı olmadığından ve farenin nefes almak için yeterli alana sahip olduğundan emin olmak için koninin burun ucunda bir kesim yapın. Koninin arkasını, koni fare ile hemen hemen aynı uzunlukta olacak şekilde kesin (böylece koni tüpün içine sığacaktır) (Şekil 1A,B). Fareyi yukarıda 2.1.3 adımlarında açıklandığı gibi tüp tutucuya yerleştirin. Farenin kuyruğunu tutarken, önce daha geniş açılan tarafı olan tutucu koniyi tüpe yerleştirin. Farenin kuyruğunu tutarken, farenin koninin içine girmesine izin verin; Ardından, koninin geri kalanını tüpün içine kaydırın. Farenin kuyruğunun tüpün arkasından tamamen dışarı çıktığından ve farenin koninin içinde nefes almak için yeri olduğundan emin olun. Farenin tamamen kısıtlandığından ve nefes almak için yeterli alana sahip olduğundan emin olurken, tüp tapasını koninin burun açıklığının hemen önüne sabitleyin. Fareyi enjekte etmek15 mL konik boruyu ılık suyla doldurun. Tüp tutucuyu, fare içindeyken yükseltilmiş platforma yerleştirin (Şekil 1B). Kısıtlanmış farenin kuyruğunu mümkün olduğunca ılık suya batırın, ta ki yan damarlar belirgin bir şekilde genişleyene ve görünür hale gelene kadar en az 1 dakika (Şekil 1B). Kuyruk ısıtma adımı sırasında, AAV dozunu şırıngaya yükleyin.Kapaksız AAV içeren 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünü bir tüp rafına yerleştirin. İğneyi baskın elinizle tüpe dikey olarak yerleştirin. İğne tüpün içine girdikten sonra, tüpü baskın olmayan elinizle tutun.NOT: İğnenin dikey olarak yerleştirilmesi, tüp duvarına dokunmaktan kaynaklanabilecek iğnenin zarar görmesini önler. Diğer alternatif şırınga yükleme yöntemleri kullanılabilir, ancak deneycinin ve enjekte edilen farenin güvenliği sağlanmalıdır. Tüpü baskın olmayan el ile tutmak, tüpü tutarken iğne sokulursa kazara iğne delinmesi yaralanmalarına karşı koruma sağlar. İğne tüpün içindeyken, iğnenin tüp duvarına temas etmediğinden emin olarak tüpü ve şırıngayı aynı anda göz hizasına kaldırın. Sabitlemek için her iki kolunuzu da masanın üzerine koyun. Dozu yavaşça şırınganın içine çekin.NOT: Yavaş aspirasyon, ince hava kabarcıklarının şırınga namlusunun kenarlarına yapışmasını engeller. Şırıngadaki hava kabarcıklarını dışarı atın. AAV enjekte ediliyorsa, hava kabarcıklarının, biyolojik tehlike kutusuna atılacak tek kullanımlık bir emici ped üzerinden şırıngadan dışarı atıldığından emin olun. Enjeksiyonu ısıtmak için en az 40 saniye tutun.NOT: Enjeksiyondan önce daima enjeksiyonun sıcak olduğundan emin olun. Soğuk enjeksiyon uygulanırsa, enjeksiyon ilk birkaç μL dışında damardan akmayabilir. Kuyruk damarlarını her dakika kontrol edin.NOT: Damarlar, enjeksiyon bölgesine kadar ÇOK görünür olmalıdır (kuyruk ısınma süresi ekleyin ve damar açıkça görünene kadar gerektiği kadar taze ılık su ile değiştirin, ancak kurumun hayvan işleme protokolü tarafından izin verilen fare kısıtlama süresini aşmamalıdır). Damarların net bir şekilde göründüğünden emin olduktan sonra, tüp tutucuyu yükseltilmiş platformun üstünden çıkarın ve tüp tutucuyu doğrudan masanın üzerine yerleştirin. Kuyruğun kolay tutulması için fareyi ayakları aşağı bakacak ve yana doğru olmayacak şekilde kısıtlayıcıya yerleştirin.NOT: Fare, sınırlayıcının içinde yan veya arka tarafında olmamalıdır. Fare tamamen kısıtlanmalı ve sınırlayıcı içinde hareket edememeli veya dönememeli veya kuyruğunu hareket ettirememeli/çekememelidir. Kuyruğu kurutmak için kuyruğu bir gazlı bezle hızlıca silin; Kuyruğu alkollü bir bezle silin ve ardından kuru bir gazlı bezle kurulayın.NOT: Kuyruğun, kuyruğun güvenli bir şekilde kavranmasına izin verecek kadar kuru hale getirmek için kuru gazlı bez kullanın, ancak tamamen kuru değil. Kuyruk tamamen kuruduğunda damarı görmek daha zor olabilir. Kuyruğu yaklaşık 90° sola veya sağa, iki yan damardan biri yukarı bakacak şekilde döndürün. Kuyruğun orta üçte birlik kısmında uygun bir enjeksiyon bölgesi bulun. İlk enjeksiyonu distal olarak (kuyruğun ucuna daha yakın) başlatın ve başarısız denemeler nedeniyle ek enjeksiyonlar gerekiyorsa veya deneysel tasarım gerektiriyorsa proksimal olarak hareket edin.NOT: Enjeksiyon önceki enjeksiyon bölgesinden dışarı sızabileceğinden, önceki bir enjeksiyon bölgesine distal enjekte etmeye çalışmayın. İsteğe bağlı: Baskın olmayan elin başparmağını ve işaret parmağını kullanarak enjeksiyon bölgesine 10 saniye boyunca proksimal (fare gövdesine yukarı/yakın) basınç uygulayın. Parmaklar, enjeksiyon bölgesindeki damarı daha da genişletmek için turnike görevi görür. 10 sn turnikeden hemen sonra, turnike parmaklarını serbest bırakın ve iki yan damardan birinin yukarı baktığından ve açıkça görülebildiğinden emin olun. Kuyruğu baskın olmayan elinizle baş parmağınızı ve işaret parmağınızı enjeksiyon bölgesinin hemen distalinde tutarak tutun. Kuyruğu işaret parmağının üzerine katlayın, böylece enjeksiyon bölgesi işaret parmağı üzerinde düz durur. Kuyruğu geri çekin, böylece kuyruk gerilir ve enjeksiyon bölgesi tamamen yatay (0°’de) (yatay tablaya paralel) olur (Şekil 1C). Şırıngayı, şırınganın namlu flanşının her iki yanındaki baskın elin işaret ve orta parmaklarını kullanarak şırıngayı tutun ve başparmağınızı pistonda hazır tutun.NOT: Bu, iğne damarın içindeyken başparmağı veya iğneyi hareket ettirmemeyi kolaylaştıracaktır (Şekil 1C). Sabitlemek için her iki elinizi de masanın üzerine koyun ve eğim yukarı bakacak şekilde iğneyi doğrudan kuyruğa ve damara paralel olarak yerleştirin. Enjeksiyon bölgesinin kontrolünü ve stabilitesini artırmak için kuyruğu tutarak enjeksiyon bölgesini işaret parmağına yakın tutun.NOT: Tüp tutucu, her iki elin de masada desteklenmesi için masada yeterince derin olmalıdır. İğneyi kuyruk damarına paralel tutarken ve iğne üzerine aşağı doğru baskı uygularken, iğneyi damarın içine doğru ileri doğru kaydırın.NOT: Aşağı doğru basınç, iğneyi damara doğru açıyla sokmak için yeterli olmalıdır. Damar son derece sığdır, bu nedenle damara girmeye çalışırken iğne mümkün olduğunca düz olmalıdır. Solüsyonu yavaşça damar içine enjekte edin. Dozu uyguladıktan sonra, iğneyi yavaşça geri çekin ve kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesinde en az 10 saniye boyunca bir gazlı bezle hemen baskı uygulayın.NOT: Enjekte edilen reaktifin olası kaybını önlemek için kanama tamamen durana kadar basıncı gerektiği kadar uygulayın. İğne çekildikten sonra genellikle iğnenin damara girdiğini gösteren bir kan damlası belirir. Bazen, başarılı bir enjeksiyonla bile kan damlası görünmez. Kan damlası enjeksiyonun başarılı olduğunu göstermez; sadece iğnenin damara girdiğini gösterir. Güvenilir başarılı enjeksiyon göstergesi, enjeksiyon sırasında piston direncinin tamamen olmamasıdır. İğne damarın içindeyse, enjeksiyonun enjeksiyonu sırasında iğne pistonunda herhangi bir direnç olmamalıdır ve enjeksiyon bölgesine yakın olan damar anlık olarak biraz daha açık renkli görünecektir (beyazlar) (damar ağarması bazı fare suşlarında çok net olmayabilir). Direnç varsa ve/veya enjeksiyon bölgesinde bir şişkinlik oluşmaya başlarsa, iğne damarın içine doğru şekilde yerleştirilmemiştir. Böyle bir durumda, iğneyi kuyruktan tamamen çıkarın ve damarı, başarısız enjeksiyon bölgesine (fare gövdesine daha yakın) proksimaldeki yeni bir enjeksiyon bölgesine enjekte etmeye çalışın. AAV ile kontamine olmuş şırıngaları ve tüpleri kurumun atık yönetimi yönergelerine göre atın. Fareyi sınırlayıcılardan kurtarın ve enjekte edilmemiş farelerden ayrı yeni bir kafese geri koyun. Enjeksiyondan sonra normal aktivite seviyelerini sağlamak için fareleri 10 dakika izleyin.NOT: Bu, bulaşıcı ajanlar uygulanırsa, enjekte edilen ajanların enjekte edilmemiş farelere potansiyel bulaşmasını önler. Bakterisit, mantar öldürücü ve virüsidal reaktif(ler) ve EtOH kullanarak çalışma alanını dezenfekte edin. Fare tüpü tutucusunu su ve sabunla temizleyin. 3. Diseksiyon ve doku toplama ve fiksasyon27 Doku toplama istasyonu hazırlığıÇalışma alanında bulunabilecek kirletici DNA’yı parçalamak için çalışma istasyonunu üreticinin talimatlarına göre bir DNA bozunma reaktifi ile temizleyin. Metilbütanı metal bir kaba koyun. Metilbütan metal kabı bir Strafor kutunun içine yerleştirin; Ardından, metal kabı kuru buzla çevreleyin, böylece kabı çevreleyen kuru buz seviyesi, kabın içindeki metilbütan seviyesinden daha yüksek olur. Boş 2 mL mikrosantrifüj doku saklama tüplerini etiketleyin ve kuru buzun üzerine yerleştirin. Dokuları dondurmaya başlamadan önce metilbütan ve doku saklama tüplerini en az 20 dakika kuru buz üzerinde soğumaya bırakın. Doku transfer forsepslerini kuru buz üzerine yerleştirin. Başka bir 2 mL mikrosantrifüj doku saklama tüpü setini etiketleyin ve taze %4 paraformaldehit (PFA) ile doldurun ve oda sıcaklığında tutun. Tüpe yerleştirilecek dokuları tamamen batırmak için her tüpe yeterli miktarda %4 PFA ekleyin. Doku toplama ve fiksasyonFareyi kurumun hayvan bakım yönergelerine göre ötenazi yapın.NOT: Burada, farelere servikal çıkık kullanılarak ötenazi yapıldı. Fareyi EtOH ile tamamen püskürtün. Gerekli dokuları toplayın.NOT: Burada açıklanan toplama ve fiksasyon protokolü iskelet kasları ve karaciğer üzerinde test edilmiştir. DNA ekstraksiyonu için kullanılacak dokular için:Dokuyu kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş metilbütan içine bırakın ve dokuyu en az 1 dakika metilbütan içinde bırakın. Donmuş dokuları metilbütandan önceden soğutulmuş boş 2 mL mikrosantrifüj doku saklama tüplerine aktarmak için önceden soğutulmuş transfer forsepslerini kullanın. Dokuyu -80 °C’de saklayın.NOT: İsteğe bağlı: Doku, adım 4.1.4’te kullanılmaya hazır olması için metilbütan içine atılmadan önce 20 mg’lık parçalar halinde kesilebilir. Histolojik analiz ve raportör proteinlerin floresansını korumak için kullanılacak dokular için:Oda sıcaklığında tutulan PFA tarafından belirlenmiş bir forseps kullanarak, dokuları %4 PFA (oda sıcaklığında tutulur) içeren ilgili mikrosantrifüj tüpüne bırakın ve dokunun %4 PFA çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun.NOT: PFA kontaminasyonu, farklı aşağı akış moleküler tahlillerini olumsuz etkileyebilir. Diğer dokuların veya aletlerin PFA kontaminasyonunu önlemek için PFA’yı tutarken yalnızca PFA tarafından belirlenmiş forseps kullanın. Mikrosantrifüj tüplerini bir rafa yerleştirin ve tüpleri karanlıkta tutmak için rafı folyo kağıtla örtün. Kapalı rafı 4 °C’de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, 5.0 g’ı çözerek 1x PBS’de% 5 sükroz (% a/h) hazırlayın. sükrozu 70 mL 1x PBS’de kuvvetli çalkalayarak karıştırın. % 5’lik bir sükroz çözeltisi (% a/h) elde etmek için 100 mL’lik nihai toplam hacme yeterli miktarda 1x PBS ekleyin. 0.22 μm şırınga filtresini kullanarak% 5 sükroz çözeltisini sterilize edin. 2.0 mL mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve taze hazırlanmış% 5 sükroz ile doldurun. Dokuları %4 PFA’dan %5 sakaroz içeren (oda sıcaklığında tutulur) ilgili mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dokunun %5 sükroz çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun. Mikrosantrifüj tüplerini bir rafa yerleştirin ve tüpleri karanlıkta tutmak için rafı folyo kağıtla örtün. Kapalı rafı 4 °C’de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, 20.0 g’ı çözerek 1x PBS’de% 20 sükroz (% a/h) hazırlayın. sükrozu 70 mL 1x PBS’de kuvvetli çalkalama ile çözün. % 20’lik bir sükroz çözeltisi (% a / h) elde etmek için 100 mL’lik nihai toplam hacme yeterli miktarda 1x PBS ekleyin. % 20’lik sükroz çözeltisini 0.22 μm’lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin. 2.0 mL mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve taze hazırlanmış% 20 sükroz ile doldurun. Dokuları %5 sakarozdan sakaroz içeren (oda sıcaklığında tutulur) ilgili mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dokunun sükroz çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun. Mikrosantrifüj tüplerini bir rafa yerleştirin ve tüpleri karanlıkta tutmak için rafı folyo kağıtla örtün. Kapalı rafı 4 °C’de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, metilbütanı metal bir kaba koyun ve metilbütan metal kabı bir Strafor kutusunun içine yerleştirin. Metal kabı kuru buzla çevreleyin, böylece kabı çevreleyen kuru buz seviyesi, kabın içindeki metilbütan seviyesinden daha yüksek olur. Boş 2 mL mikrosantrifüj doku saklama tüplerini etiketleyin ve kuru buz üzerine yerleştirin. Dokuları dondurmaya başlamadan önce metilbütan ve doku saklama tüplerini en az 20 dakika kuru buz üzerinde soğumaya bırakın. Transfer forsepslerini kuru buzun üzerine yerleştirin. Fazla sakarozdan kurtulmak için hassas mendiller kullanarak dokuları hızla kurulayın. Dokuyu kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş metilbütan içine bırakın. Dokuyu en az 1 dakika metilbütan içinde bırakın. Donmuş dokuları metilbütandan önceden soğutulmuş boş 2 mL mikrosantrifüj doku saklama tüplerine aktarmak için önceden soğutulmuş transfer forsepslerini kullanın. Dokuyu -80 °C’de saklayın. 4. vg/dg miktar tayini için dPCR Dokulardan DNA ekstraksiyonu ve ilk RNA sindirimiNOT: Bu DNA ekstraksiyon protokolünü türetmek için Malzeme Tablosunda listelenen DNA ekstraksiyon kitinin el kitabı kullanılmıştır. Donmuş doku parçalarını içeren tüpleri daima kuru buz üzerinde tutun.Bir kova buz hazırlayın. Her DNA örneği için bir adet 1.5 mL lizis boncuk tüpü ve iki adet boş RNaz içermeyen ve DNaz içermeyen 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin. Her boncuk tüpüne 180 μL ilk DNA ekstraksiyon kiti tamponu ekleyin. Tampon içeren ilk boncuk tüpünün darasını alın.NOT: Dokular adım 3.2.4.1’de önceden kesilmemişse, dokuyu 20 mg’lık parçalar halinde kesmek için kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş bir tıraş bıçağı kullanın. Bu adım, -20 °C veya daha soğukta tutulan temiz bir kriyostat içinde yapılmalıdır. Tüpe bir parça doku ekleyin; dokunun ağırlığını tartın ve kaydedin (~ 20 mg olacak). Lizis boncuk tüpünü içindeki doku ile hemen buzun üzerine yerleştirin. Tampon kristalleşebilir. Her doku örneği için önceki adımları tekrarlayın. Tüpleri lizis boncuk tüpü karıştırıcısına aktarın ve 1 ° C’de maksimum hızda (hız 10) 4 dakika çalıştırın. Numuneleri santrifüje aktarmak için buzun üzerine yerleştirin. 4 ° C’de 20.000 × g’da 1 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme aşaması sırasında, 1.7 mL’lik mikrosantrifüj tüplerinin ilk serisine 20 μL proteinaz K ekleyin. Santrifüjleme adımından sonra, homojenatların süpernatantını proteinaz K içeren 1.7 mL’lik tüplere aktarın ve iyice karıştırın. 56 ° C’de 15 dakika inkübe edin, 500 RPM karıştırın. Tüpü bir mini santrifüj kullanarak 1-2 saniye santrifüj ederek tüpün duvarlarından ve kapağından damlaları toplayın. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. 4 μL RNase A ekleyin ve kısa darbe girdabı ile karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. 15 saniye boyunca nabız girdabı. Tüpü bir mini santrifüj kullanarak 1-2 saniye santrifüj ederek tüpün duvarlarından ve kapağından damlaları toplayın. 200 μL ikinci DNA ekstraksiyon kiti tamponu ekleyin. 15 saniye boyunca nabız girdabı. Tüpü bir mini santrifüj kullanarak 1-2 saniye santrifüj ederek tüpün duvarlarından ve kapağından damlaları toplayın. 200 μL 0 EtOH ekleyin. 15 saniye boyunca nabız girdabı. Tüpü bir mini santrifüj kullanarak 1-2 saniye santrifüj ederek tüpün duvarlarından ve kapağından damlaları toplayın. Lizatları DNA ekstraksiyon spin kolonuna aktarın. 6.000 × g’da 1 dakika döndürün. Döndürme sütununu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Döndürme kolonuna 500 μL üçüncü DNA ekstraksiyon kiti tamponu ekleyin. 6.000 × g’da 1 dakika döndürün. Döndürme sütununu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Döndürme kolonuna 500 μL dördüncü DNA ekstraksiyon kiti tamponu ekleyin. 20.000 × g’da 3 dakika döndürün. Döndürme kolonunu yeni bir 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Döndürme kolonuna 100 μL moleküler dereceli su ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 6.000 × g’da döndürün. Gerekirse DNA konsantrasyonunu ölçün. Kısa süreli depolama için 4 °C’de veya uzun süreli depolama için -20 °C’de saklayın. FACS ile sıralanmış hücrelerden DNA ekstraksiyonuNOT: Bu DNA ekstraksiyon protokolünü türetmek için Malzeme Tablosunda listelenen DNA ekstraksiyon kitinin el kitabı kullanılmıştır.Hücreleri sıraladıktan sonra, yanlardaki ve kapaktaki tüm damlaları toplamak için numuneleri 5 saniye boyunca 300 × g’da santrifüjleyin. Tüm damlaların toplandığından emin olun.NOT: Numune hacmi 1.5 mL’den azsa, doğrudan bir sonraki adıma geçin. Numune hacmi 1.5 mL’den büyükse, süpernatantın üst kısmını bir mikropipet kullanarak dikkatlice çıkarın ve atın, geriye 1-1.5 mL numune bırakın. Numuneyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve numuneyi 1,7 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 515 × g’da santrifüjleyin. Son 50 μL hariç süpernatanı atın. Pelet, 100 μL’lik bir son hacim için ilk DNA ekstraksiyon kiti tamponunun 50 μL’sinde yeniden süspanse edin. Genomik DNA’nın küçük hacimlerde kandan izolasyonu için üreticinin protokolünü takip edin (bkz.10 μL proteinaz K ve 100 μL ikinci DNA ekstraksiyon kiti tamponu ekleyin; 15 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. Numuneleri 56 °C’de 300 RPM karıştırma ile 10 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon süresi boyunca numuneleri hafifçe ters çevirerek iki kez karıştırın. Tüpü bir mini santrifüj kullanarak 1-2 saniye santrifüj ederek tüpün duvarlarından ve kapağından damlaları toplayın. 50 μL 0 EtOH ekleyin ve 15 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüpü bir mini santrifüj kullanarak 1-2 saniye santrifüj ederek tüpün duvarlarından ve kapağından damlaları toplayın. Numuneleri, kenarı ıslatmadan DNA ekstraksiyon kolonuna (kolon 2 mL’lik bir toplama tüpü içindedir) aktarın. 6.000 × g’da 1 dakika santrifüjleyin. Kolonu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirdikten sonra, akışı içeren toplama tüpünü atın. Kenarı ıslatmadan kolona 500 μL üçüncü DNA ekstraksiyon kiti tamponu ekleyin ve 6.000 × g’da 1 dakika santrifüjleyin. Yine, kolonu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirdikten sonra, akışı içeren toplama tüpünü atın. Kenarı ıslatmadan kolona 500 μL dördüncü DNA ekstraksiyon kiti tamponu ekleyin ve 1 dakika boyunca 6.000 × g’da santrifüjleyin. Kolonu 2 mL’lik temiz bir toplama tüpüne yerleştirin ve akış içeren toplama tüpünü atın. 20.000 × g’da 3 dakika santrifüjleyin. Kolonu temiz bir 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve akış içeren toplama tüpünü atın. Elüsyon için kolon zarının merkezine 20 μL moleküler dereceli su ekleyin; Kapağı kapatın ve numuneleri moleküler dereceli su ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 20.000 × g’da 1 dakika santrifüjleyin. Ayrıştırılan DNA’yı kısa süreli depolama için 4 °C’de veya uzun süreli saklama için -20 °C’de saklayın. RNA sindirimi ve temizlenmesiNOT: Bu DNA temizleme protokolünü türetmek için Malzeme Tablosunda listelenen DNA ekstraksiyon kitinin el kitabı kullanılmıştır. dPCR koşullarına, reaktiflere ve primer ve prob tasarımlarına bağlı olarak, dPCR vg/dg miktar tayinine geçmeden önce DNA numunesinde RNA’nın tamamen yokluğundan emin olmak gerekebilir. RNA kontaminasyonu, belirli dPCR koşulları altında çeşitli derecelerde yanlış vg/dg değerlerine neden olabilir.0.2 mL’lik bir PCR tüpünde veya 1.7 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde, her DNA örneğine en fazla 20 μL ekstrakte edilmiş DNA örneği ve 1.5 μL DNaz içermeyen RNaz ekleyin. DNA / RNaz karışım hacmi 21.5 μL’den azsa, 21.5 μL’lik nihai hacme yeterli miktarda moleküler dereceli su ekleyin ve tüpleri ters çevirerek 25x karıştırın. 37 ° C’de 30 dakika inkübe edin ve tüpleri ters çevirerek her 10 dakikada bir periyodik olarak karıştırın.NOT: Tüpe eklenen toplam nükleik asit miktarı 175 ng ile 700 ng arasında olmalıdır. DNA örnekleri bu aralığın dışında hacimler veya nükleik asit miktarları içeriyorsa veya DNA örnekleri farklı şekilde izole edilmişse modifikasyonlar gerekebilir. 2 dakika buzun üzerine koyun. Her DNA / RNaz karışımına 100 μL’lik bir nihai hacme kadar yeterli moleküler dereceli su ekleyin.NOT: Burada listelenen RNaz, hedef DNA’yı veya aşağı akış PCR testlerini olumsuz etkilemeden kirletici RNA’yı sindirdiği için önerilir. Genomik DNA’nın temizlenmesi için üreticinin protokolünü takip edin (bkz. Malzeme Tablosu).10 μL birinci DNA ekstraksiyon kiti tamponu ve 250 μL ikinci DNA ekstraksiyon kiti tamponu ekleyin. 10 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. Numuneleri, kenarı ıslatmadan 2 mL’lik bir toplama tüpünde DNA ekstraksiyon kolonuna aktarın. 6.000 × g’da 1 dakika santrifüjleyin. Kolonu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirdikten sonra, akışı içeren toplama tüpünü atın. 500 μL’lik ikinci DNA ekstraksiyon kiti tamponunu, kenarı ıslatmadan kolona ekleyin. 6.000 × g’da 1 dakika santrifüjleyin. Kolonu 2 mL’lik temiz bir toplama tüpüne yerleştirin ve akış içeren toplama tüpünü atın. 20.000 × g’da 6 dakika santrifüjleyin. Kolonu temiz bir 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve akışı içeren toplama tüpünü atın. Elüsyon için kolon zarının ortasına 20 μL moleküler dereceli su ekleyin, kapağı kapatın ve numuneleri moleküler dereceli su ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 20.000 × g’da 1 dakika santrifüjleyin. Kısa süreli depolama için 4 °C’de veya uzun süreli depolama için -20 °C’de saklayın. Yalnızca tek bir ekzonu değil, birden fazla ekzonu kapsayan bir mRNA bölgesini amplifiye edecek bir PCR primer çifti kullanarak son nokta PCR veya dPCR veya kantitatif PCR (qPCR) ile RNaz ile sindirilmiş numunede RNA kontaminasyonunun olmadığını doğrulayın.NOT: Varsa mRNA kontaminasyonunun doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için mRNA hedefi, hedef doku/hücre tipinde yüksek oranda eksprese edilen bir gene sahip olmalıdır. Birden fazla ekzonu kapsayan amplikonlar, mRNA’yı kirleten mRNA’ya karşı genomik DNA’dan kaynaklanan bantlar arasında ayrım yapar. Varsa mRNA kontaminasyonunun tespit edilmesini sağlamak için PCR reaksiyonu için pozitif kontrol olarak her zaman RNaz sindirilmemiş bir DNA örneğine sahip olun. Dijital PCR (dPCR)Primerlerin özgüllüğünü ve optimal PCR koşullarını kontrol etmek için son nokta PCR (isteğe bağlı)Vektör genomu için dPCR primer çiftleri ve probları ve numunedeki diploid genomları ölçmek için kullanılacak fare referans geni için dPCR primer çiftleri ve probları tasarlayın.NOT: 60 bp ile 150 bp arasında amplikon boyutunu hedefleyin. Fare referans geni, diploid genom başına sabit bir gen kopya sayısına sahip bir gen olmalıdır. Burada listelenen hesaplamalar için, referans genin (Polr2a) diploid genom başına iki kopyası vardır. 10 μL uç nokta PCR reaksiyonu için, daha sonra dPCR reaksiyonu için kullanılacak reaktifleri ve nihai konsantrasyonları kullanarak PCR karışımını hazırlayın. RNaz ile sindirilmiş şablon DNA örneğini (nükleik asitler miktar aralığı 56-223 ng), DNA polimeraz ve dNTP’leri, her bir ileri primerin 0.8 μM’sini, her bir ters primerin 0.8 μM’sini, her probun 0.4 μM’sini ve 0.025 U/μL restriksiyon enzimini içeren 1x dPCR ana karışımının nihai konsantrasyonuna ekleyin (restriksiyon enziminin nihai konsantrasyonu, kullanılan restriksiyon enzimine ve markaya bağlıdır). 10 μL’lik bir nihai hacme ulaşmak için moleküler dereceli su ekleyin.NOT: PCR karışımında en az iki primer çifti ve iki prob bulunmalıdır: vektör genomunu tespit etmek için bir primer çifti ve bir prob ve fare genomunu tespit etmek için bir primer çifti ve bir prob. PCR termal döngü koşulları: 95 °C’de 2 dakika boyunca ilk ısı aktivasyon adımı, ardından 25 saniye boyunca 95 °C’de 35-45 döngü denatürasyon adımı ve 58-62 °C’de 1 dakika boyunca birleşik tavlama/uzatma adımı.NOT: Her amplikon ve astar çifti için optimum tavlama sıcaklığı belirlenmelidir. Döngü sayısı, numunedeki şablon DNA miktarına göre ayarlanabilir. Hedef amplikon bantlarının ve olası spesifik olmayan amplifikasyon bantlarının varlığını belirlemek için jel elektroforezi kullanarak PCR ürününü bir agaroz jel üzerinde görselleştirin. Primer çiftlerinin ve döngü koşullarının hedef dizilerin spesifik amplifikasyonu ile sonuçlandığını onayladıktan sonra bir sonraki dPCR adımına geçin. dPCR reaksiyonu40 μL’lik bir dPCR reaksiyonu için, DNA polimeraz ve dNTP’leri içeren 1x dPCR ana karışımının nihai konsantrasyonuna 4 μL’ye kadar RNaz ile sindirilmiş şablon DNA numunesi (nükleik asitler miktar aralığı 50-330 ng), her bir ileri primerin 0.8 μM’si, her bir ters primerin 0.8 μM’si, her probun 0.4 μM’si, ve 0.025 U/μL restriksiyon enzimi (restriksiyon enziminin nihai konsantrasyonu, restriksiyon enzimine ve kullanılan markaya bağlıdır). 40 μL’lik nihai hacme ulaşmak için moleküler dereceli su ekleyin. dPCR termal döngü koşulları: 95 °C’de 2 dakika boyunca ilk ısı aktivasyon adımı, ardından 25 saniye boyunca 95 °C’de 40-50 döngü denatürasyon adımı ve 58-62 °C’de 1 dakika boyunca birleşik tavlama/uzatma adımı.NOT: Her amplikon ve astar çifti için optimum tavlama sıcaklığı belirlenmelidir. Döngü sayısı, numunedeki şablon DNA miktarına göre ayarlanabilir. Burada listelenen hacimler, konsantrasyonlar ve koşullar, Malzeme Tablosunda listelenen dPCR plakaları, reaktifler ve cihaz için optimize edilmiştir. Bu koşullar, reaksiyonun doğruluğunu azaltabilecek herhangi bir potansiyel dPCR inhibitörünün etkisini azaltır. dPCR reaksiyonunu çalıştırdıktan ve vektör genomları ve fare referans geni için mutlak değerleri elde ettikten sonra, denklemleri (7-8) kullanarak numunede vg/dg’yi hesaplayın.İki gen kopyası/diploid genomu olan referans genler için:Diploid genomların mutlak değeri (dg) = (7)vg/dg = (8) Testin ve miktar tayininin geçerliliğini doğrulamak için dPCR reaksiyonunun 1D dağılım grafiğini kontrol edin (Şekil 3A,C). Tahlilin geçerli olması için, 1B dağılım grafiğinin aşağıdaki tüm kriterleri karşıladığını onaylayın: pozitif ve negatif bölümlerin varlığı; doğru eşik belirlemesine izin vermek için pozitif ve negatif bölümler arasında net ayrım; ve pozitif ve negatif bölümler (yağmur olarak da bilinir) arasında dPCR nicelemesinin doğruluğunu azaltabilen az veya birkaç damlacıkların varlığı.