성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

모든 동물 취급 및 주사 절차는 NINDS의 동물 보호 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 동물 시술은 NINDS 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 주입 전 준비 AAV 용량 준비주입할 마우스의 평균 체중을 결정합니다. 방정식 (1)과 같이 기관의 동물 관리 지침에 따라 최대 허용 주입량을 계산합니다. 최대 주입 부피는 일반적으로 부피(μL)/마우스 무게(g) 값(예: 10μL/g)입니다.최대 주입량(μL)/mouse= (최대 주입량(μL/g)) ×(평균 마우스 체중(g)) (1)참고: 샘플 계산: 최대 주입량/마우스 = 10 μL/g × 20 g/마우스 = 200 μL/마우스 마우스당 전달할 AAV 벡터 게놈(vg) 투여량을 설정합니다.참고: 이것은 다른 마우스에서 동일한 절대값일 수 있습니다(예: 각 마우스의 무게에 관계없이 모든 마우스는 1.5 ×10 12 vg를 받습니다). 또는 투여량은 vg/kg 단위일 수 있으므로 마우스당 주입할 총 vg는 주사 날짜에 해당 마우스의 체중에 따라 각 마우스에 대해 계산해야 합니다.투여량이 vg/kg 단위인 경우, 투여량 준비 전에 주사일에 각 마우스의 무게를 잰다. 방정식 (2)를 사용하여 체중에 따라 각 마우스에 대해 전달될 벡터 게놈을 계산합니다.특정 마우스에서 전달되는 벡터 게놈(vg) = 사전 지정된 vg/kg 값(vg/kg) × (2)참고: 특정 전임상 연구에서는 주입된 투여량 간의 유효한 비교를 보장하기 위해 vg/mouse 대신 vg/kg을 투여량 단위로 사용하는 것이 더 적절할 수 있습니다. 이것은 같은 나이의 수컷과 암컷 쥐 사이 또는 아마도 같은 성별의 마우스 사이의 체중 차이 때문입니다. 최대 주입 용량과 AAV(vg) 용량을 사용하여 필요한 용량을 준비하는 데 필요한 스톡 AAV 및 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)의 용량을 계산합니다(방정식 (3-6) 참조). 주입할 부피가 허용된 최대 주입 부피와 같거나 작은지 확인하십시오. 항상 피펫팅 오류와 주사기 데드 스페이스를 고려하여 주입할 부피보다 최소 15 μL 더 큰 주입 부피를 준비하십시오.주입액 농도(vg/μL) = (3)주입제를 준비하기 위해 추가할 총 AAV 벡터 게놈(vg) = 주입제의 농도(vg/μL) × 준비할 부피(μL)(4)주사액을 준비하기 위해 추가할 AAV 스톡의 부피) (μL) = (5)주입액을 준비하기 위해 추가할 PBS의 부피(μL) = 준비할 부피(μL) – 주입액을 준비하기 위해 추가할 AAV 스톡의 부피(μL)(6)참고: 샘플 계산:6 × 1013 vg/kg(용량)은 무게가 25g인 마우스에서 200 μL/마우스(주입할 부피)로 전달됩니다. AAV 스톡 역가는 3.0 ×10 13 (vg/mL)입니다.이 특정 마우스에서 전달될 벡터 게놈(vg) = 6 ×10 13(vg/kg) × = 1.5 × 이 마우스에 대해 1012 vg주입액의 농도 = = 7.5 × 109 (vg/μL)주사액을 준비하기 위해 추가할 총 AAV 벡터 게놈 = 7.5 × 109 (vg/μL) × (200 (μL) + 15 (μL)) = 1.6125 × 1012 (vg)주입액을 준비하기 위해 추가할 AAV 스톡의 부피 = = 53.75 (μL)주입액을 준비하기 위해 추가할 PBS의 부피 = 215 (μL) – 53.75 (μL) = 161.25 (μL) AAV 용량 준비 절차참고: AAV 취급에 대한 기관의 생물안전성 및 PPE 지침에 따라 오토클레이브 멸균 RNase-free 및 DNase-free 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에서 1.1.3.3단계의 계산에 따라 AAV 스톡 및 멸균 PBS를 사용하여 AAV 주사액을 준비합니다. 항상 스톡 AAV 및 AAV 주사를 얼음에 보관하십시오. 깨끗한 마이크로피펫과 새로운 마이크로피펫 팁 상자를 사용하여 멸균을 보장하십시오. AAV에 오염된 마이크로피펫 팁은 기관의 폐기물 관리 지침에 따라 폐기하십시오.육수 AAV를 얼음에서 해동합니다.알림: AAV 스톡을 해동 및 재냉동하지 마십시오. 100-200 μL의 부분 표본으로 AAV 재고를 주문하거나 준비하여 복용량 준비 후 재냉동해야 하는 과도한 AAV가 발생하지 않도록 하십시오. 주입 스테이션 준비청소70% 에탄올(EtOH)로 작업 영역을 청소합니다. 살균, 살균 및 바이러스 시약을 사용하여 작업 영역을 소독합니다. 마우스 튜브 조절 장치를 물과 비누로 청소하십시오. 스테이션 도구 설정깨끗하고 빈 15mL 원뿔형 튜브를 튜브 홀더/랙에 넣습니다. 마우스 튜브 고정 장치가 배치될 높은 플랫폼을 설정합니다(그림 1A,B). 깨끗한 마우스 튜브 고정 장치를 작업 영역에 놓습니다. 사용 가능한 마우스 튜브 억제 장치보다 훨씬 작은 마우스를 주입하는 경우 플라스틱 설치류 억제 원뿔을 사용하여 구속 슬리브를 만드십시오. 2.1.3-4단계를 참조하십시오. 주입에 사용할 주사기를 작업 영역에 놓습니다. 29G 바늘과 함께 0.3mL 인슐린 주사기를 사용합니다. AAV에 오염된 도구를 즉시 폐기할 수 있도록 폐기물 용기를 주입 스테이션에 가능한 한 가깝게 배치하십시오. 각 주사기의 플런저를 여러 번 당기고 밀어 플런저가 부드럽게 움직이는지 확인하여 주입 중에 주사기로 인한 저항이 없도록 합니다. 플런저가 부드럽게 움직이지 않으면 이 주사기를 폐기하고 새 주사기로 교체하십시오. 주입 부위 옆에 마우스 스케일과 미니 원심분리기를 준비하십시오. 준비된 AAV를 얼음에 올려 주사 부위에 준비합니다. 따뜻한 물(38-40 °C)을 준비합니다. 쥐 꼬리에 화상을 입지 않도록 수온이 40°C를 초과하지 않도록 주의하십시오. 2. 주입 절차 마우스 제지필요한 경우 각 마우스의 무게를 측정하여 vg/kg 단위의 복용량을 계산합니다. 마우스가 완전히 고정되어 움직일 수 없는지 확인하십시오.알림: 마우스가 완전히 구속되지 않은 경우 IV 투여 중에 마우스가 움직여 바늘이 변위될 수 있습니다. 이로 인해 바늘이 정맥에서 빠져나가거나 마우스가 다칠 수 있습니다. 튜브 구속구의 경우:마우스 사이에 따뜻한 물과 비누로 구속 장치를 세척하여 홀더를 청소하고 예열하십시오. 마우스의 꼬리를 잡습니다. 쥐의 꼬리를 튜브의 상단 구멍에 삽입합니다. 그런 다음 마우스를 튜브 고정 장치 안으로 천천히 당겨 넣습니다. 튜브 조절기의 크기가 마우스 크기에 적합한 경우 플러그를 마우스 앞에 놓아 마우스가 빠져나가지 않도록 합니다.알림: 플러그는 마우스가 튜브 내부에서 움직이거나 회전하는 것을 방지할 수 있을 만큼 마우스에 충분히 가까워야 하지만 마우스가 자유롭게 숨을 쉴 수 있도록 플러그가 마우스의 코를 막지 않아야 합니다. 마우스가 튜브 레스트레인터 크기보다 작은 경우 아래 2.1.4단계에서 설명한 대로 튜브 레스트레인 외에 유연한 일회용 레스트레이너 콘을 사용하십시오. 필요한 경우 유연한 일회용 억제 원뿔의 경우(더 작은 마우스를 위한 구속 슬리브를 만들기 위해):원뿔의 코 끝을 잘라 쥐의 코가 막히지 않고 쥐가 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인합니다. 원뿔이 마우스와 거의 같은 길이가 되도록 원뿔의 뒷면을 자릅니다(원뿔이 튜브 내부에 맞도록)(그림 1A, B). 위의 2.1.3단계에서 설명한 대로 튜브 고정 장치에 마우스를 놓습니다. 마우스의 꼬리를 잡고 더 넓은 열림면이 있는 구속 콘을 먼저 튜브에 삽입합니다. 쥐의 꼬리를 잡고 마우스가 원뿔 안으로 걸어 들어가도록하십시오. 그런 다음 원뿔의 나머지 부분을 튜브에 밀어 넣습니다. 마우스의 꼬리가 튜브 뒤쪽에서 완전히 빠져 나오고 마우스가 원뿔 내부에서 숨을 쉴 수 있는 공간이 있는지 확인합니다. 원뿔의 코 개구부 바로 앞에 튜브 플러그를 고정하고 마우스가 완전히 구속되어 있고 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인합니다. 마우스 주입15mL 원뿔형 튜브에 따뜻한 물을 채웁니다. 마우스가 들어 있는 튜브 고정 장치를 높은 플랫폼에 놓습니다(그림 1B). 측면 정맥이 명확하게 확장되고 보일 때까지 구속된 쥐의 꼬리를 따뜻한 물에 가능한 한 많이 담그십시오(그림 1B). 꼬리 워밍 단계에서 AAV 투여량을 주사기에 로드합니다.뚜껑을 닫지 않은 AAV 함유 1.7mL 미세 원심분리기 튜브를 튜브 랙에 넣습니다. 주로 사용하는 손으로 바늘을 튜브에 수직으로 삽입합니다. 바늘이 튜브 안에 들어가면 자주 사용하지 않는 손으로 튜브를 잡습니다.알림: 바늘을 수직으로 삽입하면 튜브 벽을 만져 발생할 수 있는 바늘 손상을 방지할 수 있습니다. 다른 대체 주사기 로딩 방법을 사용할 수 있지만 실험자와 주입된 마우스의 안전성이 보장되어야 합니다. 자주 사용하지 않는 손으로 튜브를 잡으면 튜브를 잡고 있는 동안 바늘을 삽입할 경우 우발적인 바늘 찔림 부상을 방지할 수 있습니다. 바늘을 튜브 안에 넣은 상태에서 바늘이 튜브 벽에 닿지 않도록 하면서 튜브와 주사기를 동시에 눈높이까지 올립니다. 두 팔을 테이블 위에 올려 안정시킵니다. 투여량을 주사기에 천천히 집어넣습니다.알림: 느린 흡인은 미세한 기포가 주사기 배럴 측면에 부착되는 것을 방지합니다. 주사기에서 기포를 배출합니다. AAV를 주입하는 경우 생물학적 위험 상자에 폐기할 일회용 흡수 패드를 통해 주사기에서 기포가 배출되었는지 확인하십시오. 주사액을 40초 이상 유지하여 예열합니다.알림: 주입하기 전에 항상 주입액이 따뜻한지 확인하십시오. 콜드 주사를 투여하면 처음 몇 μL를 제외하고는 주사가 정맥을 통해 흐르지 않을 수 있습니다. 매분마다 꼬리 정맥을 확인하십시오.참고: 정맥은 주사 부위까지 매우 잘 보여야 합니다(정맥이 명확하게 보일 때까지 꼬리 예열 시간을 추가하고 필요에 따라 신선한 따뜻한 물로 교체하되 기관의 동물 취급 프로토콜에서 허용하는 마우스 구속 시간을 초과해서는 안 됨). 정맥이 명확하게 보이는지 확인한 후 높은 플랫폼 상단에서 튜브 고정 장치를 제거하고 튜브 고정 장치를 테이블 위에 직접 놓습니다. 꼬리를 쉽게 다룰 수 있도록 발을 옆이 아닌 아래쪽으로 하여 마우스를 억제 장치에 놓습니다.알림: 마우스는 옆으로 눕거나 억제 장치 내부에 뒤로 있어서는 안 됩니다. 마우스는 완전히 구속되어야 하며 구속 장치 내에서 움직이거나 회전하거나 꼬리를 움직이거나 당길 수 없어야 합니다. 거즈로 꼬리를 빠르게 닦아 꼬리를 말리십시오. 알코올 면봉으로 꼬리를 닦은 후 마른 거즈로 물기를 닦아냅니다.알림: 마른 거즈를 사용하여 꼬리를 단단히 잡을 수 있을 만큼 충분히 건조시키되 완전히 건조되지는 않도록 하십시오. 꼬리가 완전히 건조되면 정맥을 보는 것이 더 어려울 수 있습니다. 꼬리를 왼쪽이나 오른쪽으로 약 90° 회전하여 두 개의 측면 정맥 중 하나가 위쪽을 향하도록 합니다. 꼬리의 중간 1/3 이내에 적합한 주사 부위를 찾습니다. 초기 주입을 원위(꼬리 끝에 더 가까움)로 시작하고 실패한 시도로 인해 추가 주입이 필요하거나 실험 설계에 의해 필요한 경우 근접하게 이동합니다.알림: 주사액이 이전 주사 부위에서 누출될 수 있으므로 이전 주사 부위에 원위부로 주사를 시도하지 마십시오. 선택 사항: 주로 사용하지 않는 손의 엄지와 검지를 사용하여 주사 부위에 10초 동안 근접(마우스 본체에 상류/더 가까운)에 압력을 가합니다. 손가락은 주사 부위의 정맥을 더욱 확장시키는 지혈대 역할을 합니다. 10초 지혈대 직후 지혈대 손가락을 놓고 두 측면 정맥 중 하나가 위쪽을 향하고 명확하게 보이는지 확인합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 엄지와 검지를 주사 부위 바로 원위부에서 사용합니다. 주사 부위가 집게 손가락에 평평하게 놓이도록 꼬리를 집게 손가락 위로 접습니다. 꼬리가 늘어나고 주입 부위가 완전히 수평(0°에서)이 되도록 꼬리를 뒤로 당깁니다(수평 테이블과 평행)(그림 1C). 주사기의 배럴 플랜지 양쪽에 있는 우세한 손의 검지와 중지를 사용하여 주사기를 잡고 엄지 손가락을 플런저에 준비합니다.알림: 이렇게 하면 바늘이 정맥 내부에 들어가면 엄지손가락이나 바늘을 움직이지 않는 것이 더 쉬워집니다(그림 1C). 양손을 테이블 위에 올려 안정시키고 바늘을 경사가 위쪽을 향하도록 하여 꼬리와 정맥에 직접 평행하게 놓습니다. 주사 부위의 제어력과 안정성을 향상시키기 위해 꼬리를 잡고 있는 검지 손가락에 주사 부위를 가깝게 유지하십시오.알림: 튜브 고정 장치는 두 손이 테이블에서 지지될 수 있도록 테이블에서 충분히 깊숙이 있어야 합니다. 바늘을 꼬리 정맥과 평행하게 유지하고 바늘에 아래쪽 압력을 가하면서 바늘을 정맥 쪽으로 앞으로 밀어 넣습니다.알림: 하향 압력은 바늘을 정맥에 올바른 각도로 삽입하기에 충분해야 합니다. 정맥은 매우 얕기 때문에 정맥에 들어가려고 할 때 바늘은 가능한 한 평평해야 합니다. 용액을 정맥에 천천히 주입하십시오. 투여 후 천천히 바늘을 빼고 즉시 주사 부위에 거즈로 10초 이상 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.알림: 주입된 시약의 잠재적인 손실을 방지하기 위해 출혈이 완전히 멈출 때까지 필요한 만큼 압력을 가하십시오. 핏방울은 일반적으로 바늘을 빼낸 후에 나타나며 바늘이 정맥을 관통했음을 나타냅니다. 간혹 주사를 성공적으로 맞아도 핏방울이 나오지 않는 경우가 있습니다. 혈액 방울은 성공적인 주입을 나타내지 않습니다. 바늘이 정맥을 관통했다는 것을 나타낼 뿐입니다. 신뢰할 수 있는 성공적인 주입 지표는 주입 중 플런저 저항이 완전히 없다는 것입니다. 바늘이 정맥 내부에 있는 경우 주사액을 주입하는 동안 바늘 플런저에 저항이 없어야 하며 주사 부위에 근접한 정맥이 일시적으로 약간 밝은 색(반점)으로 나타납니다(일부 마우스 균주에서는 정맥 희시가 명확하지 않을 수 있음). 저항이 있거나 주사 부위에 돌출부가 나타나기 시작하면 바늘이 정맥 내부에 올바르게 배치되지 않은 것입니다. 이 경우 꼬리에서 바늘을 완전히 제거하고 실패한 주사 부위(마우스 본체에 더 가까움)에 근접한 새로운 주사 부위에 정맥을 주입하려고 시도합니다. AAV에 오염된 주사기와 튜브는 기관의 폐기물 관리 지침에 따라 폐기하십시오. 구속 장치에서 마우스를 풀어주고 주입되지 않은 마우스와 분리된 새 케이지에 다시 넣습니다. 주입 후 정상적인 활동 수준을 확인하기 위해 10분 동안 마우스를 모니터링합니다.참고: 이는 전염성 약물을 투여하는 경우 주입된 약물이 주입되지 않은 마우스로 전염될 가능성을 방지합니다. 살균, 살균 및 바이러스 시약과 70% EtOH를 사용하여 작업 영역을 소독합니다. 마우스 튜브 조절 장치를 물과 비누로 청소하십시오. 3. 해부 및 조직 채취 및 고정27 조직 수집 스테이션 준비작업 영역에 존재할 수 있는 오염된 DNA를 분해하기 위한 제조업체의 지침에 따라 DNA 분해 시약으로 작업 스테이션을 청소합니다. 금속 용기에 메틸부탄을 넣습니다. 메틸부탄 금속 용기를 스티로폼 상자 안에 넣습니다. 그런 다음 금속 용기를 드라이 아이스로 둘러싸서 용기를 둘러싼 드라이 아이스의 수준이 용기 내부의 메틸 부탄 수준보다 높도록합니다. 라벨을 붙이고 빈 2mL 마이크로 원심분리기 조직 보관 튜브를 드라이아이스 위에 놓습니다. 메틸부탄과 조직 보관 튜브를 드라이아이스에서 최소 20분 동안 식힌 후 티슈를 얼리기 시작합니다. 조직 이송 겸자를 드라이 아이스 위에 놓습니다. 다른 2mL 마이크로 원심분리기 조직 보관 튜브 세트에 라벨을 붙이고 새로운 4% 파라포름알데히드(PFA)를 채우고 실온에서 보관합니다. 튜브에 넣을 조직을 완전히 담글 수 있도록 각 튜브에 충분한 4% PFA를 추가합니다. 조직 채취 및 고정기관의 동물 보호 지침에 따라 쥐를 안락사시킵니다.참고: 여기에서 쥐는 자궁경부 탈구를 사용하여 안락사되었습니다. 마우스에 70% EtOH를 완전히 분무합니다. 필요한 조직을 수집합니다.참고: 여기에 설명된 수집 및 고정 프로토콜은 골격근과 간에서 테스트되었습니다. DNA 추출에 사용될 조직의 경우:드라이아이스에 미리 냉각된 메틸부탄에 티슈를 떨어뜨리고 티슈를 메틸부탄에 최소 1분 동안 그대로 둡니다. 사전 냉각된 이송 겸자를 사용하여 메틸부탄의 동결 조직을 사전 냉각된 빈 2mL 미세 원심분리기 조직 보관 튜브로 옮깁니다. 티슈를 -80 °C에서 보관하십시오.참고: 선택 사항: 조직을 20mg 조각으로 자르기 전에 메틸부탄을 떨어뜨려 4.1.4단계에서 사용할 수 있도록 준비할 수 있습니다. 조직학적 분석 및 리포터 단백질의 형광 보존에 사용될 조직의 경우:실온에서 보관된 PFA 지정 겸자를 사용하여 4% PFA(실온에서 보관)가 포함된 각각의 미세 원심분리기 튜브에 조직을 떨어뜨리고 조직이 4% PFA 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다.참고: PFA 오염은 다양한 다운스트림 분자 분석에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 다른 조직이나 도구의 PFA 오염을 방지하기 위해 PFA를 취급할 때만 PFA 지정 겸자를 사용하십시오. 마이크로 원심분리기 튜브를 랙에 놓고 랙을 호일 종이로 덮어 튜브를 어둡게 유지합니다. 뚜껑이 있는 랙을 4 °C에서 셰이커에 넣고 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 격렬한 흔들림으로 5.0g의 자당 70mL에 1x PBS를 용해시켜 1x PBS에 5% 자당(% w/v)을 준비합니다. 5% 자당 용액(% w/v)을 얻기 위해 최종 총 부피 100mL에 충분한 1x PBS를 추가합니다. 5μm 주사기 필터를 사용하여 0.22% 자당 용액을 멸균합니다. 2.0mL 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 갓 준비한 5% 자당을 채웁니다. 4% PFA의 조직을 5% 자당(실온에서 보관)이 포함된 각각의 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기면서 조직이 5% 자당 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 랙에 놓고 랙을 호일 종이로 덮어 튜브를 어둡게 유지합니다. 뚜껑이 있는 랙을 4 °C에서 셰이커에 넣고 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 격렬한 흔들림으로 1x PBS 70mL에 20.0g의 자당을 용해시켜 1x PBS에서 20% 자당(% w/v)을 준비합니다. 20% 자당 용액(% w/v)을 얻기 위해 최종 총 부피 100mL에 충분한 1x PBS를 추가합니다. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 20% 자당 용액을 멸균합니다. 2.0mL 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 갓 준비한 20% 자당을 채웁니다. 5% 자당의 조직을 20% 자당(실온에서 보관)이 포함된 각각의 미세 원심분리 튜브로 옮기면서 조직이 20% 자당 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 랙에 놓고 랙을 호일 종이로 덮어 튜브를 어둡게 유지합니다. 뚜껑이 있는 랙을 4 °C에서 셰이커에 넣고 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다. 하룻밤 배양 후 메틸부탄을 금속 용기에 넣고 메틸부탄 금속 용기를 스티로폼 상자 안에 넣습니다. 금속 용기를 드라이 아이스로 둘러싸서 용기를 둘러싼 드라이 아이스 수준이 용기 내부의 메틸 부탄 수준보다 높도록합니다. 라벨을 부착하고 빈 2mL 미세 원심분리기 조직 보관 튜브를 드라이아이스 위에 놓습니다. 메틸부탄과 조직 보관 튜브를 드라이아이스에서 최소 20분 동안 식힌 후 티슈를 얼리기 시작합니다. 드라이 아이스 위에 이송 겸자를 놓습니다. 정밀 물티슈를 사용하여 조직을 빠르게 닦아내어 초과 20% 자당을 제거합니다. 드라이 아이스에 미리 냉각 된 메틸 부탄에 티슈를 떨어 뜨립니다. 조직을 메틸부탄에 최소 1분 동안 그대로 두십시오. 사전 냉각된 이송 겸자를 사용하여 메틸부탄의 동결 조직을 사전 냉각된 빈 2mL 미세 원심분리기 조직 보관 튜브로 옮깁니다. 티슈를 -80 °C에서 보관하십시오. 4. vg/dg 정량화를 위한 dPCR 조직에서 DNA 추출 및 초기 RNA 분해참고: 재료 표 에 나열된 DNA 추출 키트의 핸드북은 이 DNA 추출 프로토콜을 도출하는 데 사용되었습니다. 얼린 티슈 조각이 들어있는 튜브는 항상 드라이 아이스에 보관하십시오.얼음 양동이를 준비합니다. 각 DNA 샘플에 대해 1.5mL 용해 비드 튜브 1개와 빈 RNase-free 및 DNase-free 1.7mL 미세 원심분리기 튜브 2개를 라벨링합니다. 첫 번째 DNA 추출 키트 완충액 180μL를 각 비드 튜브에 추가합니다. 완충액을 함유하는 첫 번째 비드 튜브를 용기로 만듭니다.참고: 3.2.4.1단계에서 티슈를 미리 절단하지 않은 경우 드라이아이스에 미리 냉각된 면도날을 사용하여 티슈를 20mg 조각으로 자릅니다. 이 단계는 -20 °C 이하로 유지되는 깨끗한 저온 유지 장치 내에서 수행해야 합니다. 튜브에 조직 한 조각을 추가하십시오. 조직의 무게를 측정하고 기록합니다(~20mg). 조직이 들어 있는 용해 비드 튜브를 즉시 얼음 위에 놓습니다. 버퍼가 결정화될 수 있습니다. 각 조직 샘플에 대해 이전 단계를 반복합니다. 튜브를 용해 비드 튜브 블렌더로 옮기고 4°C에서 최대 속도(속도 10)로 1분 동안 실행합니다. 샘플을 얼음 위에 올려 원심분리기로 옮깁니다. 4°C에서 20,000× g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 원심분리 단계에서 1.7mL 미세 원심분리기 튜브의 첫 번째 시리즈에 20μL의 proteinase K를 추가합니다. 원심분리 단계 후, 균질액의 상층액을 proteinase K가 포함된 1.7mL 튜브로 옮기고 잘 섞는다. 56°C에서 500RPM으로 혼합하여 15분 동안 배양합니다. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다. 4 μL의 RNase A를 추가하고 간단한 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다. 15초 동안 펄스 소용돌이. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 두 번째 DNA 추출 키트 완충액 200μL를 추가합니다. 15초 동안 펄스 소용돌이. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 200μL의 100% EtOH를 첨가합니다. 15초 동안 펄스 소용돌이. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 용해물을 DNA 추출 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 6,000× g 에서 1분 동안 회전합니다. 스핀 컬럼을 새 수집 튜브에 넣습니다. 세 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 스핀 컬럼에 추가합니다. 6,000 ×g 에서 1분 동안 회전합니다. 스핀 컬럼을 새 수집 튜브에 넣습니다. 스핀 컬럼에 네 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 추가합니다. 20,000× g 에서 3분 동안 회전합니다. 스핀 컬럼을 새 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 스핀 컬럼에 분자 등급 물 100μL를 추가합니다. 실온에서 1분 동안 배양합니다. 6,000× g 에서 실온에서 1분 동안 회전합니다. 필요한 경우 DNA 농도를 측정합니다. 단기 보관의 경우 4 °C, 장기 보관의 경우 -20 °C에서 보관하십시오. FACS 분류 세포에서 DNA 추출참고: 재료 표 에 나열된 DNA 추출 키트의 핸드북은 이 DNA 추출 프로토콜을 도출하는 데 사용되었습니다.세포를 분류한 후 샘플을 300× g 에서 5초 동안 원심분리하여 측면과 뚜껑에 있는 모든 방울을 수집합니다. 모든 방울이 수집되었는지 확인하십시오.참고: 시료 부피가 1.5mL 미만인 경우 다음 단계로 바로 진행하십시오. 시료 부피가 1.5mL보다 큰 경우 마이크로피펫을 사용하여 상층액의 상단 부분을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 샘플의 1-1.5mL를 남겨둡니다. 위아래로 여러 번 피펫팅하여 검체를 혼합하고 검체를 1.7mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 515× g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 마지막 50 μL를 제외한 상층액을 폐기합니다. 펠릿을 첫 번째 DNA 추출 키트 완충액 50 μL에 재현탁시켜 최종 부피 100 μL를 만듭니다. 소량의 혈액에서 게놈 DNA를 분리하기 위한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오( 재료 표 참조).10 μL의 proteinase K와 100 μL의 두 번째 DNA 추출 키트 완충액을 추가합니다. 15초 동안 펄스 소용돌이로 혼합합니다. 56°C에서 300RPM으로 혼합하여 10분 동안 샘플을 배양합니다. 이 배양 기간 동안 부드러운 반전으로 샘플을 두 번 혼합합니다. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 50μL의 100% EtOH를 첨가하고 15초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 테두리를 적시지 않고 샘플을 DNA 추출 컬럼(컬럼은 2mL 수집 튜브에 있음)으로 옮깁니다. 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리기 깨끗한 2mL 수집 튜브에 컬럼을 넣은 후 플로우스루가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 세 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 림을 적시지 않고 컬럼에 추가하고 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 다시 말하지만, 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣은 후 플로우스루가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 네 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 림을 적시지 않고 컬럼에 추가하고 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 플로우스루 함유 수집 튜브를 폐기합니다. 20,000 × g 에서 3분 동안 원심분리기 컬럼을 깨끗한 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 넣고 플로우스루 함유 수집 튜브를 폐기합니다. 용리를 위해 20μL의 분자 등급 물을 컬럼 멤브레인 중앙에 추가합니다. 뚜껑을 닫고 실온에서 분자 등급 물로 5분 동안 샘플을 배양합니다. 20,000× g 에서 1분 동안 원심분리기 용리된 DNA를 단기 보관의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -20°C에서 보관합니다. RNA 분해 및 세척참고: 재료 표 에 나열된 DNA 추출 키트의 핸드북은 이 DNA 클린업 프로토콜을 도출하는 데 사용되었습니다. dPCR 조건, 시약, 프라이머 및 프로브 설계에 따라 dPCR vg/dg 정량을 진행하기 전에 DNA 샘플에 RNA가 완전히 없는지 확인해야 할 수 있습니다. RNA 오염은 특정 dPCR 조건에서 다양한 정도의 부정확한 vg/dg 값을 초래할 수 있습니다.0.2 mL PCR 튜브 또는 1.7 mL 미세 원심분리기 튜브에 추출된 DNA 샘플의 최대 20 μL와 DNase-free RNase의 1.5 μL를 각 DNA 샘플에 추가합니다. DNA/RNase 혼합물 부피가 21.5 μL 미만인 경우 최종 부피 21.5 μL에 분자 등급 물을 충분히 추가하고 튜브를 뒤집어 25배 혼합합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하고 튜브를 뒤집어 10 분마다 주기적으로 혼합합니다.참고: 튜브에 첨가되는 핵산의 총량은 175ng에서 700ng 사이여야 합니다. DNA 샘플에 이 범위를 벗어난 부피 또는 핵산 양이 포함되어 있거나 DNA 샘플이 다르게 분리된 경우 수정이 필요할 수 있습니다. 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 각 DNA/RNase 혼합물에 최종 부피 100 μL까지 충분한 분자 등급 물을 추가합니다.참고: 여기에 나열된 RNase는 타겟 DNA 또는 다운스트림 PCR 분석에 부정적인 영향을 주지 않고 오염된 RNA를 분해하기 때문에 권장됩니다. 게놈 DNA 청소에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오( 재료 표 참조).첫 번째 DNA 추출 키트 완충액 10μL와 두 번째 DNA 추출 키트 완충액 250μL를 추가합니다. 10초 동안 펄스 소용돌이로 혼합합니다. 테두리를 적시지 않고 2mL 수집 튜브에 담긴 DNA 추출 컬럼으로 샘플을 옮깁니다. 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리기 깨끗한 2mL 수집 튜브에 컬럼을 넣은 후 플로우스루가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 두 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 림을 적시지 않고 컬럼에 추가합니다. 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리기 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 플로우스루 함유 수집 튜브를 폐기합니다. 20,000 × g 에서 6분 동안 원심분리기 깨끗한 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브에 컬럼을 넣고 플로우스루가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 용출을 위해 컬럼 멤브레인 중앙에 분자 등급 물 20μL를 추가하고 뚜껑을 닫은 다음 분자 등급 물과 함께 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 20,000 × g 에서 1분 동안 원심분리기 단기 보관의 경우 4 °C, 장기 보관의 경우 -20 °C에서 보관하십시오. 단일 엑손뿐만 아니라 여러 엑손에 걸쳐 있는 mRNA 영역을 증폭하는 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 종말점 PCR 또는 dPCR 또는 정량적 PCR(qPCR)로 RNase 분해 샘플에서 RNA 오염이 없는지 확인합니다.참고: mRNA 표적은 mRNA 오염이 존재하는 경우 올바르게 식별할 수 있도록 표적 조직/세포 유형에서 고도로 발현된 유전자여야 합니다. 여러 엑손에 걸쳐 있는 앰플리콘은 mRNA와 게놈 DNA의 오염으로 인한 띠를 구별합니다. mRNA 오염이 있는 경우 이를 검출할 수 있도록 항상 RNase가 아닌 분해된 DNA 샘플을 PCR 반응에 대한 양성 대조군으로 사용하십시오. 디지털 PCR(dPCR)primer의 특이성 및 최적의 PCR 조건을 확인하기 위한 End-point PCR(선택 사항)벡터 게놈에 대한 dPCR 프라이머 쌍 및 프로브를 설계하고 샘플의 이배체 게놈을 정량화하는 데 사용할 마우스 참조 유전자에 대한 dPCR 프라이머 쌍 및 프로브를 설계합니다.참고: 60 bp에서 150 bp 사이의 앰플리콘 크기를 목표로 하십시오. 마우스 참조 유전자는 이배체 게놈당 일정한 유전자 복제 수를 갖는 유전자여야 합니다. 여기에 나열된 계산을 위해 참조 유전자(Polr2a)는 이배체 게놈당 2개의 복사본을 가지고 있습니다. 10 μL 말점 PCR 반응의 경우 나중에 dPCR 반응에 사용할 시약과 최종 농도를 사용하여 PCR 혼합물을 준비합니다. DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 1x dPCR 마스터 믹스 1x dPCR 마스터 믹스, 각 전방 프라이머 0.8μM, 각 역방향 프라이머 0.8μM, 각 프로브 0.4μM 및 제한 효소 0.025U/μL의 최종 농도에 RNase 분해 템플릿 DNA 샘플(핵산 양 범위 56-223ng)을 추가합니다(제한 효소의 최종 농도는 사용된 제한 효소 및 브랜드에 따라 다름). 분자 등급의 물을 첨가하여 최종 부피 10μL에 도달합니다.참고: PCR 믹스에는 적어도 두 개의 프라이머 쌍과 두 개의 프로브가 있어야 합니다: 벡터 게놈을 검출하기 위한 프라이머 쌍 1개와 프로브 1개, 마우스 게놈을 검출하기 위한 프라이머 쌍 1개와 프로브 1개. PCR 열 순환 조건: 95°C에서 2분 동안 초기 열 활성화 단계, 95°C에서 25초 동안 변성 단계를 35-45회 주기하고 58-62°C에서 1분 동안 결합 어닐링/확장 단계를 수행합니다.참고: 최적의 어닐링 온도는 각 앰플리콘 및 프라이머 쌍에 대해 결정해야 합니다. 사이클의 수는 샘플의 템플릿 DNA의 양에 따라 조정할 수 있습니다. 겔 전기영동을 사용하여 아가로스 겔에서 PCR 산물을 시각화하여 표적 앰플리콘 띠 및 가능한 비특이적 증폭 띠의 존재를 확인합니다. 프라이머 쌍과 순환 조건이 타겟 염기서열의 특정 증폭을 초래하는지 확인한 후 다음 dPCR 단계로 진행합니다. dPCR 반응40 μL dPCR 반응의 경우, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 1x dPCR 마스터 믹스의 최종 농도에 RNase 분해 템플릿 DNA 샘플(핵산 양 범위 50-330 ng)을 최대 4 μL, 각 전방 프라이머의 0.8 μM, 각 역방향 프라이머의 0.8 μM, 각 프로브의 0.4 μM, 및 0.025 U/μL의 제한효소(제한효소의 최종 농도는 사용된 제한효소 및 브랜드에 따라 다름). 분자 등급의 물을 추가하여 최종 부피가 40μL에 도달합니다. dPCR 열 순환 조건: 95°C에서 2분 동안 초기 열 활성화 단계, 95°C에서 25초 동안 변성 단계의 40-50 사이클, 1분 동안 58-62°C에서 결합 어닐링/확장 단계.참고: 최적의 어닐링 온도는 각 앰플리콘 및 프라이머 쌍에 대해 결정해야 합니다. 사이클의 수는 샘플에서 템플릿 DNA의 양에 따라 조정할 수 있습니다. 여기에 나열된 부피, 농도 및 조건은 재료 표에 나열된 dPCR 플레이트, 시약 및 장치에 최적화되어 있습니다. 이러한 조건은 반응의 정확도를 감소시킬 수 있는 잠재적인 dPCR 억제제의 효과를 감소시킵니다. dPCR 반응을 실행하고 벡터 게놈 및 마우스 참조 유전자에 대한 절대값을 얻은 후 방정식 (7-8)을 사용하여 샘플에서 vg/dg를 계산합니다.두 개의 유전자 사본/이배체 게놈이 있는 참조 유전자의 경우:이배체 게놈의 절대값(dg) = (7)VG / DG = (8) dPCR 반응의 1D 산점도를 확인하여 분석 및 정량화의 타당성을 확인합니다(그림 3A,C). 분석이 유효하려면 1D 산점도가 다음 기준을 모두 충족하는지 확인하십시오. 정확한 임계값 결정을 허용하기 위해 양수 파티션과 음수 파티션 사이의 명확한 분리; 그리고 양극과 음극 칸막이 사이에 물방울이 거의 없는 경우(비라고도 함), 이는 dPCR 정량화의 정확도를 감소시킬 수 있습니다.