Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması
Summary
Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.
Abstract
Ticari satıcılardan bir dizi modifiye sentetik oligonükleotidin mevcudiyeti, herhangi bir standart moleküler biyoloji laboratuvarında çalıştırılabilen nükleik asit metabolize edici enzimlerin çeşitli özelliklerini karakterize etmek için karmaşık tahlillerin geliştirilmesine izin vermiştir. Floresan etiketlerin kullanılması, bu yöntemleri, radyoaktif malzemeler kullanmadan veya radyoaktif malzemelerin depolanması ve hazırlanması için tasarlanmış bir laboratuvar, yani bir Sıcak Laboratuvar gerektirmeden, standart PAGE elektroforez ekipmanı ve floresan özellikli bir görüntüleyiciye sahip araştırmacılar için erişilebilir hale getirmiştir. Fosforilasyon gibi standart modifikasyonların isteğe bağlı olarak eklenmesi, tahlil kurulumunu basitleştirebilirken, DNA hasarlarını veya ara ürünleri taklit eden modifiye edilmiş nükleotidlerin spesifik olarak dahil edilmesi, enzim davranışının belirli yönlerini araştırmak için kullanılabilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen sentetik oligonükleotidler kullanılarak enzimler tarafından DNA işlemenin çeşitli yönlerini sorgulamak için tahlillerin tasarımı ve yürütülmesi gösterilmektedir. Bunlar, ligazların farklı DNA ve RNA hibrit yapılarını bozmak için ligazların birleşme veya nükleazların yeteneğini, DNA ligaz tarafından diferansiyel kofaktör kullanımını ve enzimlerin DNA bağlama kapasitesinin değerlendirilmesini içerir. Sentetik nükleotid substratları tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken faktörler tartışılır ve bir dizi nükleik asit ligaz, polimeraz ve nükleaz enzim tahlili için kullanılabilecek temel bir oligonükleotid seti sağlanır.
Introduction
Tüm yaşam formları, replikasyon, transkripsiyon ve DNA onarımı dahil olmak üzere temel biyolojik süreçleri gerçekleştirmek için nükleik asit işleme enzimlerine ihtiyaç duyar. Bu yollar için temel enzimatik işlevler, RNA/DNA moleküllerinin kopyalarını üreten polimerazlar, polinükleotid substratlarına katılan ligazlar, bunları bozan nükleazlar ve nükleik asit duplekslerini eriten veya topolojilerini değiştiren helikazlar ve topoizomerazlardır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Ek olarak, bu enzimlerin birçoğu klonlama, teşhis ve yüksek verimli dizileme gibi uygulamalar için gerekli moleküler araçları sağlar 11,12,13,14,15.
Bu enzimlerin fonksiyonel özellikleri, kinetiği ve substrat özgüllükleri, oligonükleotidlerin tavlanmasıyla üretilen etiketli DNA/RNA substratları kullanılarak belirlenebilir. Alt tabakaların ve ürünlerin izlenmesi geleneksel olarak, daha sonra fotoğraf filmi veya bir fosfor görüntüleme sistemi16,17 ile tespit edilebilen 5′ iplikçik ucuna bir radyoaktif etiket (32P) yerleştirilerek gerçekleştirilmiştir. Radyoaktif işaretli substratlar, artan deneysel hassasiyet avantajı sunarken ve bir nükleotidin kimyasal özelliklerini değiştirmezken, radyoizotoplarla çalışmaktan kaynaklanan potansiyel sağlık tehlikeleri, DNA ve RNA tespiti için daha güvenli bir alternatif sağlamak için radyoaktif olmayan nükleik asit etiketlemesinin geliştirilmesini teşvik etmiştir 18,19,20. Bunlar arasında, doğrudan floresan algılama, zamana bağlı floresan ve enerji transferi/floresan söndürme testleri dahil olmak üzere floresan algılama, en çok yönlü 21,22,23,24 olarak öne çıkıyor. Geniş florofor dizisi, her oligonükleotid25 üzerinde benzersiz raporlayıcılar içeren farklı DNA/RNA substratları tasarımlarını mümkün kılar. Ek olarak, floroforların stabilitesi, radyoizotoplarla karşılaştırıldığında, kullanıcıların önemli miktarlarda floresan etiketli DNA substratları üretmesine ve korumasına olanak tanır19. Bu florofor etiketli substratlar, bağlanma ve/veya enzim aktivitesini analiz etmek için farklı metal ve nükleotid kofaktör kombinasyonları ile birlikte ilgilenilen protein ile inkübe edilebilir. Jel görüntüleme sistemi ile çeşitli florofor boya kanalları kullanılarak bağlanma veya aktivitenin görselleştirilmesi gözlemlenebilir. Bu teknik kullanılarak yalnızca floresan olarak işaretlenmiş oligonükleotidler görülebileceğinden, etiketli oligonükleotidin boyutundaki herhangi bir artış veya azalmayı takip etmek kolay olacaktır. Jeller daha sonra, jel üzerinde bulunan tüm DNA bantlarını görselleştirmek için nükleik asit boyama boyaları ile de boyanabilir.
Poli-nükleik asit ligazları, DNA/RNA fragmanlarını birleştiren, 5′ fosforile DNA terminalleri ile DNA’nın 3′ OH’si arasında bir fosfodiester bağı oluşturarak kırılmaların sızdırmazlığını katalize eden enzimlerdir. Nükleotid substrat gereksinimlerine göre iki gruba ayrılabilirler. Yüksek oranda korunmuş NAD’ye bağımlı ligazlar tüm bakterilerdebulunur 26 yapısal olarak çeşitli ATP’ye bağımlı enzimler yaşamın tüm alanlarında tanımlanabilir 8,27. DNA ligazları, replikasyon sırasında Okazaki fragmanının işlenmesinde önemli bir rol oynamanın yanı sıra, onarımdan sonra kalan spontan çentiklerin ve çentiklerin sızdırmazlığı yoluyla nükleotid ve baz eksizyon onarımı gibi çeşitli DNA onarım yollarında yer alır 8,10. Farklı DNA ligazları, çift yönlü çentikler, çift sarmallı kırılmalar, uyumsuzluklar ve boşlukların yanı sıra RNA ve DNA hibritleri 28,29,30 dahil olmak üzere farklı DNA kırılma konformasyonlarını birleştirmek için değişen kapasiteler sergiler. Bir nükleik asit dubleks31,32,33’te yan yana 5′ ve 3′ terminaller oluşturmak için oligonükleotidlerin 5′ fosfat ile tavlanmasıyla çok çeşitli ligatlanabilir substratlar birleştirilebilir. En yaygın analiz yöntemi, bir uç nokta tahlil formatında üre PAGE ile çözünürlüktür; Bununla birlikte, son yenilikler arasında, yüksek verime34, kütle spektrometrik profillemeye35 izin veren kılcal jel elektroforezinin yanı sıra zamana bağlı izlemeye36 izin veren homojen bir moleküler işaret testinin kullanımı yer almaktadır.
Bir ligasyon reaksiyonundaki ilk adım, ligaz enziminin adenozin trifosfat (ATP) veya Nikotinamid adenin dinükleotidi (NAD) ile aderilasyonudur ve bu da bir kovalent enzim ara maddesi ile sonuçlanır. Reaksiyondaki ikinci adım, çentik bölgesinin 5′ ucundaki nükleik asit substratının adenilasyonudur, bunu nükleik asit çentik ipliklerinin ligasyonu takip eder. E. coli’de rekombinant olarak eksprese edilen birçok ligaz enzimi, adenillenmiş formda saflaştırılır ve bu nedenle, bir nükleotid kofaktörü eklenmeden nükleik asitleri başarılı bir şekilde bağlayabilir. Bu, nükleik asitlerin ligasyonu için hangi belirli tipte nükleotid kofaktörüne ihtiyaç duyduklarını belirlemeyi zorlaştırır. DNA ligaz aktivitesini değerlendirmek için tahlilleri tanımlamaya ek olarak, etiketlenmemiş substratlar kullanarak enzimi dedenilasyon yaparak kofaktör kullanımını güvenilir bir şekilde belirlemek için bir yöntem de sunulmaktadır.
Nükleazlar, nükleik asitler37 arasındaki fosfodiester bağlarını parçalayan geniş ve çeşitli bir DNA/RNA modifiye edici enzimler ve katalitik RNA’lar grubudur. Nükleaz enzim işlevleri, DNA replikasyonu, onarımı ve RNA işlemede gereklidir ve DNA, RNA veya her ikisi için şeker özgüllüklerine göre sınıflandırılabilir. Endonükleazlar, bir DNA/RNA zinciri içindeki fosfodiester bağlarını hidrolize ederken, eksonükleazlar DNA/RNA zincirlerini 3′ veya 5′ ucundan her seferinde bir nükleotidi hidrolize eder ve bunu DNA’nın 3′ ila 5′ veya 5′ ila 3′ ucundan yapabilir38.
Birçok nükleaz proteini spesifik değildir ve birden fazla süreçte yer alabilirken, diğerleri belirli bir dizi veya DNA hasarı için oldukça spesifiktir 6,39,40. Diziye özgü nükleazlar, klonlama, mutajenez ve genom düzenleme gibi çok çeşitli biyoteknolojik uygulamalarda kullanılır. Bu uygulamalar için popüler nükleazlar, kısıtlama nükleazları41, çinko parmak nükleazları42, transkripsiyonel aktivatör benzeri efektör nükleazlar ve en son olarak, RNA güdümlü tasarlanmış CRISPR nükleazları43’tür. Uyumsuzluğa özgü RecB benzeri nükleaz alanı 5,44 aracılığıyla DNA’daki uyumsuzluklar için özgüllüğe sahip olan EndoMS nükleaz gibi hasara özgü nükleazlar yakın zamanda tanımlanmıştır. Nükleaz aktivite deneyleri, tarihsel olarak, radyoaktif işaretli substratlar ile süreksiz deneyler olarak yapılmıştır; Bununla birlikte, diğer dezavantajlarına ek olarak, bunlar, floresan etiketli substratlar45,46 kullanıldığında mümkün olan bir nükleaz proteini tarafından kesilen bölgenin tanımlanmasına izin vermez. Daha yakın zamanlarda, farklı durumlarda DNA ile etkileşime giren farklı DNA boyaları kullanarak çalışan sürekli nükleaz tahlilleri geliştirilmiştir; örneğin, dsDNA ile etkileşime girdiğinde, bağlanmamış durumundan daha yüksek bir floresan sinyali yaymak veya spesifik olarak kısa RNA’larabağlanmak 47. Diğer sürekli nükleaz tahlilleri, 5′ ucunda bir florofor grubu ve 3′ ucunda bir söndürücü bulunan DNA saç tokaları kullanır, böylece florofor ve söndürücü48’in ayrılması nedeniyle oligonükleotid bozuldukça floresan artar. Bu tahliller, DNA parçalayıcı proteinlerin kinetiğini karakterize etmeye izin verirken, enzimin işlevi ve substratı hakkında önceden bilgi gerektirir ve ayrıca boya bağlanmasında bir farka neden olmak için DNA konformasyonunu değiştiren enzimlerle sınırlıdır. Bu nedenle, tek tek nükleaz ürünlerini çözen son nokta tahlilleri, protein aktivitesinin neden olduğu DNA modifikasyonları hakkında bilgi sağlamak için hala arzu edilir.
Burada, yeni nükleaz, polimeraz ve ligaz enzimlerinin aktivitesini test etmek için substratlar oluşturmak üzere karıştırılabilen ve eşleştirilebilen floresan etiketli DNA/RNA oligonükleotidlerinin tasarımı için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu temel oligonükleotid dizileri setinin doğrulanması, deneysel tasarımı basitleştirir ve çok sayıda ısmarlama substrat satın almaya gerek kalmadan çok çeşitli enzimatik işlevlerin ekonomik profilini çıkarmayı kolaylaştırır. DNA ligaz aktivitesi örneği kullanılarak, bu substratlarla standart bir DNA işleme enzim testinin çalıştırılması için ayrıntılı bir prosedür sağlanmıştır ve nükleaz ve polimeraz enzimlerinin tahlil edilmesi ve analiz edilmesi için modifikasyonlar açıklanmaktadır. Ek olarak, DNA ligaz enziminin kofaktör özgüllüğünü yüksek doğrulukla belirlemek için modifiye edilmiş bir test verilir ve çok bileşenli ligasyonların montajını değerlendirmek için çift etiketli problar kullanılır. Son olarak, elektroforetik hareketlilik kaydırma testi (EMSA) ile aynı substratlarla protein-DNA etkileşimlerini belirlemek için kullanılmasına izin vermek için temel tahlil formatındaki modifikasyonlar tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoldeki kritik adımlar
Oligonükleotid tasarımı ve satın alma: Dubleks oluşumu için oligonükleotidleri satın alırken, dizi tasarımını dikkate almak önemlidir. 57 siparişinden önce GC içeriği, erime sıcaklığı, ikincil yapı ve dimerizasyon potansiyeli gibi nükleotid dizisinin özelliklerini tahmin etmek için bir oligo analizör aracının kullanılması önerilir.
Nükleik asit duplekslerinin montajı ve tavlanması: RNA/RN…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AW, bir Rutherford Keşif Bursu (20-UOW-004) tarafından desteklenmektedir. RS, Yeni Zelanda Post Antarktika Bursu’nun sahibidir.SG ve UR, teknik destek için Norveç Arktik Üniversitesi olan Tromsø Üniversitesi Kimya Enstitüsü’ne teşekkür eder.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution (29:1) | BioRad | 1610156 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Many suppliers | ||
| Ammonium persulfate (APS) | Many suppliers | ||
| Benchtop centrifuge | Many suppliers | ||
| Borate | Many suppliers | ||
| Bromophenol blue | Many suppliers | ||
| Dithiothreitol (DTT) | Many suppliers | ||
| Electrophoresis system with circulating water bath | Many suppliers | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Many suppliers | ||
| Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000 | Thermo Fisher Scientific | A32752 | |
| Formamide | Many suppliers | ||
| Gel casting system | Many suppliers | ||
| Heating block | Many suppliers | ||
| Magnesium Chloride | Many suppliers | Other metal ions may be preferred depending on the protein studied | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Many suppliers | ||
| Micropipettes and tips | Many suppliers | 1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) | Many suppliers | ||
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | NA | Thermo Fisher, Sigma-Aldrich, Genscript and others also supply these |
| pasture pipette | Many suppliers | ||
| PCR thermocycler | Many suppliers | ||
| PCR tubes | Many suppliers | ||
| RNAse away | ThermoFisher | 7002PK | Only needed when working with RNA oligos |
| RNase AWAY | Merck | 83931-250ML | Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces |
| RNAse-free water | New England Biolabs | B1500L | Only needed when working with RNA oligos |
| Sodium Chloride | Many suppliers | ||
| SUPERase IN RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based) |
| SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides |
| Tetramethylethylenediamine (TMED) | Many suppliers | ||
| Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane | Many suppliers | ||
| Ultrapure water (Milli-Q) | Merck | ||
| urea | Many suppliers | ||
| Vortex | Many suppliers |
Referenzen
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363 (6429), eaav7003 (2019).
- Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
- Lohman, T. M., Fazio, N. T. How does a helicase unwind DNA? Insights from RecBCD Helicase. Bioessays. 40 (6), e1800009 (2018).
- Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Res. 45 (20), 12025-12038 (2017).
- Wozniak, K. J., Simmons, L. A. Bacterial DNA excision repair pathways. Nat Rev Microbiol. 20 (8), 465-477 (2022).
- Zhang, L., Jiang, D., Wu, M., Yang, Z., Oger, P. M. New insights into DNA repair revealed by NucS endonucleases from hyperthermophilic Archaea. Front Microbiol. 11, 1263 (2020).
- Saathoff, J. H., Kashammer, L., Lammens, K., Byrne, R. T., Hopfner, K. P. The bacterial Mre11-Rad50 homolog SbcCD cleaves opposing strands of DNA by two chemically distinct nuclease reactions. Nucleic Acids Res. 46 (21), 11303-11314 (2018).
- Williamson, A., Leiros, H. S. Structural insight into DNA joining: from conserved mechanisms to diverse scaffolds. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8225-8242 (2020).
- Caglayan, M. Interplay between DNA polymerases and DNA ligases: Influence on substrate channeling and the fidelity of DNA ligation. J Mol Biol. 431 (11), 2068-2081 (2019).
- Shuman, S. DNA ligases: Progress and prospects. J Biol Chem. 284 (26), 17365-17369 (2009).
- Lohman, G. J., Tabor, S., Nichols, N. M. DNA ligases. Curr Prot Mol Biol. Chapter 3 (Unit 3.14), (2011).
- Rittié, L., Perbal, B. Enzymes used in molecular biology: a useful guide. J Cell Commun Signal. 2 (1-2), 25-45 (2008).
- Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of programmable nucleases for genome engineering. J Mol Biol. 428 (5, Part B), 963-989 (2016).
- Aschenbrenner, J., Marx, A. DNA polymerases and biotechnological applications. Curr Opin Biotechnol. 48, 187-195 (2017).
- Loenen, W. A. M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 42 (1), 3-19 (2013).
- Voytas, D., Ke, N. Detection and quantitation of radiolabeled proteins and DNA in gels and blots. Curr Protoc Immunol. Appendix 3 (A), (2002).
- Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
- Huang, C., Yu, Y. T. Synthesis and labeling of RNA in vitro. Curr Prot Mol Biol. Chapter 4, Unit 4.15 (2013).
- Ballal, R., Cheema, A., Ahmad, W., Rosen, E. M., Saha, T. Fluorescent oligonucleotides can serve as suitable alternatives to radiolabeled oligonucleotides. J Biomol Tech. 20 (4), 190-194 (2009).
- Anderson, B. J., Larkin, C., Guja, K., Schildbach, J. F. Using fluorophore-labeled oligonucleotides to measure affinities of protein-DNA interactions. Meth Enzymol. 450, 253-272 (2008).
- Liu, W., et al. Establishment of an accurate and fast detection method using molecular beacons in loop-mediated isothermal amplification assay. Sci Rep. 7 (1), 40125 (2017).
- Ma, C., et al. Simultaneous detection of kinase and phosphatase activities of polynucleotide kinase using molecular beacon probes. Anal Biochem. 443 (2), 166-168 (2013).
- Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Meth Mol Biol. 429, 209-224 (2008).
- Yang, C. J., Li, J. J., Tan, W. Using molecular beacons for sensitive fluorescence assays of the enzymatic cleavage of nucleic acids. Meth Mol Biol. 335, 71-81 (2006).
- Nikiforov, T. T., Roman, S. Fluorogenic DNA ligase and base excision repair enzyme assays using substrates labeled with single fluorophores. Anal Biochem. 477, 69-77 (2015).
- Pergolizzi, G., Wagner, G. K., Bowater, R. P. Biochemical and structural characterisation of DNA ligases from bacteria and Archaea. Biosci Rep. 36 (5), 00391 (2016).
- Martin, I. V., MacNeill, S. A. ATP-dependent DNA ligases. Genome Biol. 3 (4), REVIEWS3005 (2002).
- Bilotti, K., et al. Mismatch discrimination and sequence bias during end-joining by DNA ligases. Nucleic Acids Res. 50 (8), 4647-4658 (2022).
- Bauer, R. J., et al. Comparative analysis of the end-joining activity of several DNA ligases. PLoS One. 12 (12), e0190062 (2017).
- Lohman, G. J. S., Zhang, Y., Zhelkovsky, A. M., Cantor, E. J., Evans, T. C. Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1831-1844 (2014).
- Bullard, D. R., Bowater, R. P. Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem J. 398 (1), 135-144 (2006).
- Magnet, S., Blanchard, J. S. Mechanistic and kinetic study of the ATP-dependent DNA ligase of Neisseria meningitidis. Biochemie. 43 (3), 710-717 (2004).
- Williamson, A., Grgic, M., Leiros, H. S. DNA binding with a minimal scaffold: structure-function analysis of Lig E DNA ligases. Nucleic Acids Res. 46 (16), 8616-8629 (2018).
- Lohman, G. J., et al. A high-throughput assay for the comprehensive profiling of DNA ligase fidelity. Nucleic Acids Res. 44 (2), e14 (2016).
- Kim, J., Mrksich, M. Profiling the selectivity of DNA ligases in an array format with mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 38 (1), e2 (2010).
- Tang, Z. W., et al. Real-time monitoring of nucleic acid ligation in homogenous solutions using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (23), e148 (2003).
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Q Rev Biophys. 44 (1), 1-93 (2011).
- Marti, T. M., Fleck, O. DNA repair nucleases. Cell Mol Life Sci. 61 (3), 336-354 (2004).
- Wang, B. B., et al. Review of DNA repair enzymes in bacteria: With a major focus on AddAB and RecBCD. DNA Repair. 118, 103389 (2022).
- Pidugu, L. S., et al. Structural insights into the mechanism of base excision by MBD4. J Mol Biol. 433 (15), 167097 (2021).
- Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 5905-5908 (2005).
- Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Takemoto, N., Numata, I., Su’etsugu, M., Miyoshi-Akiyama, T. Bacterial EndoMS/NucS acts as a clamp-mediated mismatch endonuclease to prevent asymmetric accumulation of replication errors. Nucleic Acids Res. 46 (12), 6152-6165 (2018).
- Reardon, J. T., Sancar, A. Molecular anatomy of the human excision nuclease assembled at sites of DNA damage. Mol Cell Biol. 22 (16), 5938-5945 (2002).
- Kunkel, T. A., Soni, A. Exonucleolytic proofreading enhances the fidelity of DNA synthesis by chick embryo DNA polymerase-gamma. J Biol Chem. 263 (9), 4450-4459 (1988).
- Sheppard, E. C., Rogers, S., Harmer, N. J., Chahwan, R. A universal fluorescence-based toolkit for real-time quantification of DNA and RNA nuclease activity. Sci Rep. 9 (1), 8853 (2019).
- Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 28 (11), E52 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sharma, J. K., et al. Methods for competitive enrichment and evaluation of superior DNA ligases. Meth Enzymol. 644, 209-225 (2020).
- Rzoska-Smith, E., Stelzer, R., Monterio, M., Cary, S. C., Williamson, A. DNA repair enzymes of the Antarctic Dry Valley metagenome. Front Microbiol. 14, 1156817 (2023).
- Williamson, A., Pedersen, H. Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida. Protein Expres Purif. 97, 29-36 (2014).
- Akey, D., et al. Crystal structure and nonhomologous end-joining function of the ligase component of Mycobacterium DNA ligase D. J Biol Chem. 281 (19), 13412-13423 (2006).
- Kim, D. J., et al. ATP-dependent DNA ligase from Archaeoglobus fulgidus displays a tightly closed conformation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 65 (Pt 6), 544-550 (2009).
- Nishida, H., Kiyonari, S., Ishino, Y., Morikawa, K. The closed structure of an archaeal DNA ligase from Pyrococcus furiosus. J Mol Biol. 360 (5), 956-967 (2006).
- Gundesø, S., et al. R2D ligase: Unveiling a novel DNA ligase with surprising DNA-to-RNA ligation activity. Biotechnol J. 19 (3), e2300711 (2024).
- Hendling, M., Barišić, I. In silico design of DNA oligonucleotides: Challenges and approaches. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1056-1065 (2019).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harb Prot. 2019 (2), (2019).
- Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), 1485 (2009).
- Smith, D. R. Gel Electrophoresis of DNA. Mol Biometh Handbook. , 17-33 (1998).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Rousseau, M., et al. Characterisation and engineering of a thermophilic RNA ligase from Palaeococcus pacificus. Nucleic Acids Res. 52 (7), 3924-3937 (2024).
- Kestemont, D., Herdewijn, P., Renders, M. Enzymatic synthesis of backbone-modified oligonucleotides using T4 DNA ligase. Curr Prot Chem Biol. 11 (2), e62 (2019).
- Farell, E. M., Alexandre, G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 5, 257 (2012).
- Nazarenko, I., Pires, R., Lowe, B., Obaidy, M., Rashtchian, A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 30 (9), 2089-2195 (2002).
.