修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

すべての生命体は、複製、転写、DNA修復などの基本的な生物学的プロセスを実行するために核酸処理酵素を必要とします。これらの経路の主要な酵素的機能性は、RNA/DNA分子のコピーを生成するポリメラーゼ、ポリヌクレオチド基質を結合するリガーゼ、それらを分解するヌクレアーゼ、および核酸二本鎖を溶かしたり、そのトポロジーを変化させたりするヘリカーゼとトポイソメラーゼです1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .さらに、これらの酵素の多くは、クローニング、診断、ハイスループットシーケンシングなどのアプリケーションに不可欠な分子ツールを提供します11,12,13,14,15。

これらの酵素の機能特性、速度論、および基質特異性は、オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって産生される標識DNA/RNA基質を用いて決定できます。基板および製品の追跡は、伝統的に、5’鎖端のいずれかに放射性標識(^32P)を導入することによって達成され、これはその後、写真フィルムまたは蛍光体イメージングシステム^16,17によって検出することができる。放射性標識基質は、実験感度の向上という利点を提供し、ヌクレオチドの化学的性質を変化させないが、放射性同位元素を扱うことによる潜在的な健康被害は、DNAおよびRNA検出のためのより安全な代替手段を提供するための非放射性核酸標識の開発を促進している18,19,20.これらの中で、直接蛍光検出、時間分解蛍光、エネルギー移動/蛍光消光アッセイなどの蛍光検出は、最も汎用性の高いアッセイとして際立っています21,22,23,24。広範な蛍光色素の配列により、各オリゴヌクレオチド²⁵上に独自のレポーターを特徴とするDNA/RNA基質の異なる設計が可能になります。さらに、蛍光色素の安定性は、放射性同位元素と比較した場合、ユーザーは蛍光標識されたDNA基質を大量に生成し保存することができる¹⁹。これらの蛍光色素標識基質は、目的のタンパク質とインキュベートし、金属およびヌクレオチド補因子のさまざまな組み合わせとともに、結合活性や酵素活性を解析できます。結合または活性の可視化は、ゲルイメージングシステムを備えたさまざまな蛍光色素チャネルを使用して観察できます。この手法では蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのみが見えるため、標識されたオリゴヌクレオチドのサイズの増減を容易に追跡できます。ゲルは、その後、核酸染色色素を使用してゲル上に存在するすべてのDNAバンドを視覚化することもできます。

ポリ核酸リガーゼは、DNA/RNAの断片を結合する酵素であり、5’リン酸化DNA末端とDNAの3’OHとの間のホスホジエステル結合の形成により、切断のシーリングを触媒します。それらは、ヌクレオチド基質の要件に応じて2つのグループに分けることができます。高度に保存されたNAD依存性リガーゼはすべての細菌に見出され²⁶、構造的に多様なATP依存性酵素^は、生命の全ての領域を通じて同定することができる^8,27。DNAリガーゼは、複製中の岡崎フラグメントプロセシングに重要な役割を果たすとともに、自発的な傷や修復後に残る傷の封鎖を通じて、ヌクレオチドや塩基除去修復などのさまざまなDNA修復経路に関与しています^8,10。異なるDNAリガーゼは、二本鎖のニック、二本鎖切断、ミスマッチ、ギャップ、ならびにRNAおよびDNAハイブリッド28,29,30を含む、DNA切断の異なるコンフォメーションを結合するさまざまな能力を示す。オリゴヌクレオチドを5’リン酸でアニーリングすることにより、多様な結合性基質を組み立てることができ、核酸二本鎖31,32,33に並置された5’末端と3’末端を生成します。最も一般的な分析方法は、エンドポイントアッセイ形式での尿素PAGEによる分離です。しかし、最近の技術革新には、ハイスループットを可能にするキャピラリーゲル電気泳動³⁴、質量分析プロファイリング³⁵、および時間分解モニタリング³⁶を可能にする均質分子ビーコンアッセイの使用が含まれる。

ライゲーション反応の最初のステップは、アデノシン三リン酸(ATP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)によるリガーゼ酵素のアデニル化であり、共有結合酵素中間体が得られます。反応の第2ステップは、ニック部位の5’末端の核酸基質のアデニル化であり、続いて核酸ニック鎖のライゲーションが行われます。 大腸菌 で組換え発現する多くのリガーゼ酵素は、アデニル化形態で精製されるため、ヌクレオチド補因子を添加することなく核酸をうまくライゲーションすることができます。これにより、核酸のライゲーションに必要な特定のタイプのヌクレオチド補因子を決定することが困難になります。DNAリガーゼ活性を評価するためのアッセイについて説明するだけでなく、非標識基質を用いて酵素を脱アデニル化することにより補因子の使用量を確実に決定する方法も提示されます。

ヌクレアーゼは、DNA/RNA修飾酵素および触媒RNAの大規模で多様なグループであり、核酸間のホスホジエステル結合を切断する³⁷。ヌクレアーゼ酵素の機能は、DNAの複製、修復、およびRNAプロセシングに必要であり、DNA、RNA、またはその両方に対する糖特異性によって分類できます。エンドヌクレアーゼはDNA/RNA鎖内のホスホジエステル結合を加水分解し、一方、エキソヌクレアーゼはDNA/RNA鎖を3’または5’末端から一度に1ヌクレオチドを加水分解し、^DNA38の3’末端から5’末端または5’末端から3’末端のいずれかから加水分解することができる。

多くのヌクレアーゼタンパク質は非特異的であり、複数のプロセスに関与している可能性があるが、他のタンパク質は特定の配列またはDNA損傷に対して非常に特異的である^6,39,40。配列特異的ヌクレアーゼは、クローニング、突然変異誘発、ゲノム編集など、幅広いバイオテクノロジー用途で使用されています。これらのアプリケーションのための一般的なヌクレアーゼは、制限ヌクレアーゼ⁴¹、ジンクフィンガーヌクレアーゼ⁴²、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、そして最近では、RNA誘導改変CRISPRヌクレアーゼ⁴³である。最近、損傷特異的なヌクレアーゼが同定されており、例えばEndoMSヌクレアーゼは、ミスマッチ特異的なRecB様ヌクレアーゼドメイン^5,44を通じてDNAのミスマッチに対して特異性を有する。ヌクレアーゼ活性アッセイは、歴史的に、放射性標識基質を用いた不連続アッセイとして行われてきました。しかしながら、それらの他の欠点に加えて、これらは、蛍光標識基質^45,46を使用する場合に可能なヌクレアーゼタンパク質によって切断された部位の同定を可能にしない。最近では、さまざまな状態でDNAと相互作用するさまざまなDNA色素を使用して機能する連続ヌクレアーゼアッセイが開発されました。例えば、dsDNAと相互作用するとき、その非結合状態よりも高い蛍光シグナルを放出するか、または短いRNAに特異的に結合する⁴⁷。他の連続ヌクレアーゼアッセイでは、5’にフルオロフォア基、3’末端にクエンチャーを持つDNAヘアピンを使用し、フルオロフォアとクエン^チャー48の分離によりオリゴヌクレオチドが分解されるにつれて蛍光が増加するようにします。これらのアッセイでは、DNA分解タンパク質の動態を特徴付けることができますが、酵素の機能と基質に関する事前の知識が必要であり、また、DNAコンフォメーションを変化させて色素結合に違いを引き起こす酵素に限定されます。このため、個々のヌクレアーゼ産物を分離するエンドポイントアッセイは、タンパク質活性によって引き起こされるDNA修飾に関する洞察を得るために依然として望ましいです。

ここでは、新規ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、およびリガーゼ酵素の活性を試験するための基質を生成するために混合および適合させることができる蛍光標識DNA/RNAオリゴヌクレオチドの設計に関する詳細な手順を示します。このオリゴヌクレオチド配列の基本セットの検証により、実験デザインが簡素化され、特注の基質を大量に購入することなく、幅広い酵素機能の経済的なプロファイリングが容易になります。DNAリガーゼ活性の例を用いて、これらの基質を用いて標準的なDNAプロセッシング酵素アッセイを実行するための詳細な手順が提供され、ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ酵素をアッセイおよび分析するための修飾が説明されている。さらに、DNAリガーゼ酵素の補因子特異性を高精度で決定するための修正アッセイが提供され、二重標識プローブを使用して多成分ライゲーションの集合が評価されます。最後に、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって同じ基質とのタンパク質-DNA相互作用を決定するために使用できるようにするための基本的なアッセイフォーマットの変更について説明します。