שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

כל צורות החיים דורשות אנזימים לעיבוד חומצות גרעין כדי לבצע תהליכים ביולוגיים בסיסיים, כולל שכפול, שעתוק ותיקון DNA. פונקציות אנזימטיות עיקריות עבור מסלולים אלה הן פולימראזות, אשר מייצרות עותקים של מולקולות RNA/DNA, ליגאזות המצטרפות למצעי פולינוקלאוטידים, נוקלאזות המשפילות אותן, ומנחתים וטופואיזומראזות, אשר ממיסים דופלקסים של חומצות גרעין או משנים את הטופולוגיה שלהם 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . בנוסף, רבים מהאנזימים הללו מספקים כלים מולקולריים חיוניים ליישומים כגון שיבוט, אבחון וריצוף בתפוקה גבוהה 11,12,13,14,15.

המאפיינים הפונקציונליים, הקינטיקה וייחודיות המצע של אנזימים אלה ניתנים לקביעה באמצעות מצעי DNA/RNA מסומנים המיוצרים על ידי חישול אוליגונוקלאוטידים. מעקב אחר מצעים ומוצרים הושג באופן מסורתי על ידי הצגת תווית רדיואקטיבית (³²P) בקצה גדיל 5 ‘, אשר לאחר מכן ניתן לזהות על ידי סרט צילום או עם מערכת הדמיה זרחן^16,17. בעוד שמצעים עם תווית רדיואקטיבית מציעים את היתרון של רגישות ניסויית מוגברת ואינם משנים את התכונות הכימיות של נוקלאוטיד, הסיכונים הבריאותיים הפוטנציאליים מעבודה עם רדיואיזוטופים עודדו את הפיתוח של תיוג חומצות גרעין לא רדיואקטיביות כדי לספק חלופה בטוחה יותר לזיהוי DNA ו- RNA 18,19,20 . בין אלה, זיהוי פלואורסצנטי, כולל זיהוי פלואורסצנטיות ישיר, פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן ומבחני העברת אנרגיה/פלואורסצנטיות בולטים כ-21,22,23,24 הרב-תכליתיים ביותר. המערך הנרחב של פלואורופורים מאפשר עיצובים שונים של מצעי DNA/RNA הכוללים כתבים ייחודיים על כל אוליגונוקלאוטיד²⁵. בנוסף, יציבותם של פלואורופורים, בהשוואה לרדיואיזוטופים, מאפשרת למשתמשים לייצר ולשמר כמויות משמעותיות של מצעי DNA המסומנים באופן פלואורסצנטי¹⁹. ניתן לדגור על מצעים אלה המסומנים בפלואורופור עם החלבון המעניין, יחד עם שילובים שונים של גורמים משלימים של מתכת ונוקלאוטידים, כדי לנתח את פעילות הקישור או האנזים. הדמיה של קשירה או פעילות ניתן לראות באמצעות תעלות צבע פלואורופור שונות עם מערכת הדמיה ג’ל. מכיוון שרק אוליגונוקלאוטידים המסומנים באופן פלואורסצנטי יהיו גלויים באמצעות טכניקה זו, כל עלייה או ירידה בגודל האוליגונוקלאוטיד המסומן תהיה קלה לעקוב. ג’לים יכולים גם להיות מוכתמים לאחר מכן, עם צבעים מכתימים חומצת גרעין כדי לדמיין את כל רצועות ה- DNA הקיימות על הג’ל.

ליגאזות של חומצות גרעין הן אנזימים המצטרפים למקטעים של DNA/RNA, ומזרזים את אטימת השברים על ידי יצירת קשר פוספודיסטר בין טרמיני DNA פוספורילציה 5′ לבין 3′ OH של DNA. ניתן לחלק אותם לשתי קבוצות בהתאם לדרישת מצע הנוקלאוטידים שלהם. הליגאזות התלויות ב-NAD שהשתמרו מאוד נמצאות בכל חיידקי²⁶ ואילו את האנזימים תלויי ה-ATP המגוונים מבחינה מבנית ניתן לזהות בכל תחומי החיים ^8,27. ליגאזות DNA ממלאות תפקיד חשוב בעיבוד מקטעי אוקזקי במהלך השכפול, כמו גם מעורבות במסלולי תיקון DNA שונים, כגון נוקלאוטיד ותיקון כריתת בסיס, באמצעות איטום ניקים וניקים ספונטניים שנותרים לאחר תיקון ^8,10. ליגאזות דנ”א שונות מציגות יכולות שונות להצטרף לקונפורמציות שונות של שברי דנ”א, כולל ניקים בדופלקס, שברים דו-גדיליים, אי-התאמות ורווחים, כמו גם היברידיות RNA ו-DNA 28,29,30. ניתן להרכיב מגוון רחב של מצעים ניתנים לליגה על ידי חישול אוליגונוקלאוטידים עם פוספט 5′ כדי ליצור טרמיני 5′ ו-3′ בדופלקס חומצות גרעין 31,32,33. שיטת הניתוח הנפוצה ביותר היא רזולוציה על ידי אוריאה PAGE בפורמט בדיקת נקודת קצה; עם זאת, חידושים אחרונים כללו שימוש באלקטרופורזה של ג’ל נימי, המאפשר תפוקה גבוהה³⁴, פרופיל ספקטרומטרי מסה³⁵, כמו גם בדיקת משואות מולקולרית הומוגנית, המאפשרת ניטור בזמן³⁶.

הצעד הראשון בתגובת קשירה הוא אדנילציה של אנזים ליגאז על ידי אדנוזין טריפוספט (ATP) או ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD), וכתוצאה מכך אנזים קוולנטי מתווך. השלב השני בתגובה הוא אדנילציה של מצע חומצת הגרעין בקצה 5′ של אתר הניק, ואחריו קשירה של גדילי ניק חומצת הגרעין. אנזימי ליגאז רבים המתבטאים באופן רקומביננטי ב- E. coli מטוהרים בצורה אדנילציה, ולכן מסוגלים לשדר בהצלחה חומצות גרעין ללא תוספת של קו-פקטור נוקלאוטיד. זה מקשה לקבוע איזה סוג מסוים של קו-פקטור נוקלאוטידים הם דורשים עבור קשירת חומצות גרעין. בנוסף לתיאור בדיקות להערכת פעילות ליגאז DNA, מוצגת גם שיטה לקביעת שימוש בקו-פקטור באופן מהימן על ידי דה-אדנילציה של האנזים באמצעות מצעים לא מסומנים.

נוקלאזות הן קבוצה גדולה ומגוונת של אנזימים לשינוי DNA/RNA ורנ”א קטליטי המנתקים את קשרי הפוספודיסטרים בין חומצות גרעין³⁷. תפקודי אנזימי נוקלאז נדרשים בשכפול, תיקון ועיבוד DNA וניתן לסווגם לפי ספציפיות הסוכר שלהם עבור DNA, RNA או שניהם. אנדונוקלאזות מבצעות הידרוליזה של קשרי פוספודיזטר בתוך גדיל דנ”א/רנ”א, בעוד אקסונוקלאזות הידרוליזות של גדילי דנ”א/רנ”א גוועדות נוקלאוטיד אחד בכל פעם מקצה ה-3′ או ה-5′ או ה-5′ עד הקצה ה-5′ של הדנ”א³⁸‘.

בעוד חלבוני נוקלאז רבים אינם ספציפיים ועשויים להיות מעורבים בתהליכים מרובים, אחרים ספציפיים מאוד עבור רצף מסוים או נזק לדנ”א ^6,39,40. נוקלאזות ספציפיות לרצף משמשות במגוון רחב של יישומים ביוטכנולוגיים, כגון שיבוט, מוטגנזה ועריכת גנום. נוקלאזות פופולריות ליישומים אלה הן נוקלאזות הגבלה⁴¹, נוקלאזות אצבע אבץ⁴², נוקלאזות אפקט דמוי מפעיל שעתוק 43, ולאחרונה, נוקלאזות CRISPR מהונדסות מונחות רנ”א⁴³. לאחרונה זוהו נוקלאזות ספציפיות לנזק, כגון נוקלאז EndoMS, שיש לו ספציפיות לאי-התאמות בדנ”א באמצעות תחום הנוקלאז דמוי RecB ^5,44 הספציפי לאי-התאמה. מבחני פעילות נוקלאז, מבחינה היסטורית, נעשו כבדיקות לא רציפות עם מצעים מסומנים ברדיו; עם זאת, בנוסף לחסרונות האחרים שלהם, אלה אינם מאפשרים זיהוי של האתר שנחתך על ידי חלבון נוקלאז, אשר אפשרי בעת שימוש במצעים מסומנים פלואורסצנטית^45,46. לאחרונה פותחו מבחני נוקלאז רציפים הפועלים באמצעות צבעי דנ”א שונים המקיימים אינטראקציה עם דנ”א במצבים שונים; לדוגמה, פליטת אות פלואורסצנטי גבוה יותר בעת אינטראקציה עם dsDNA מאשר במצבו הלא קשור, או קשירה ספציפית לרנ”א קצר⁴⁷. בדיקות נוקלאז רציפות אחרות משתמשות בסיכות ראש DNA עם קבוצת פלואורופורים בקצה 5′ ומרווה בקצה 3′, כך שהפלואורסצנטיות עולה ככל שהאוליגונוקלאוטיד מתפרק עקב הפרדה בין הפלואורופור למרווה⁴⁸. בעוד שבדיקות אלה מאפשרות לאפיין את הקינטיקה של חלבונים מפרקים DNA, הן דורשות ידע מוקדם על תפקוד האנזים והמצע ומוגבלות גם לאנזימים המשנים את קונפורמציית הדנ”א כדי לגרום להבדל בקישור הצבע. מסיבה זו, מבחני נקודות קצה שפותרים תוצרי נוקלאז בודדים עדיין רצויים כדי לספק תובנה לגבי שינויים בדנ”א הנגרמים על ידי פעילות החלבון.

כאן, מוצג הליך מפורט לתכנון אוליגונוקלאוטידים של DNA/RNA המסומנים באופן פלואורסצנטי שניתן לערבב ולהתאים ליצירת מצעים לבדיקת הפעילות של אנזימי נוקלאז, פולימראז וליגאז חדשים. האימות של קבוצה בסיסית זו של רצפי אוליגונוקלאוטידים מפשט את התכנון הניסיוני ומאפשר פרופיל חסכוני של מגוון רחב של פונקציות אנזימטיות ללא צורך לרכוש מספר רב של מצעים בהתאמה אישית. הליך מפורט מסופק להפעלת בדיקת אנזים סטנדרטית לעיבוד DNA עם מצעים אלה, תוך שימוש בדוגמה של פעילות ליגאז DNA ומתוארים שינויים להערכה וניתוח של אנזימי נוקלאז ופולימראז. בנוסף, ניתנת בדיקה שונה לקביעת ספציפיות הקו-פקטור של אנזים ליגאז ה- DNA בדיוק גבוה, ובדיקות בעלות תווית כפולה משמשות להערכת הרכבה של קשירה מרובת רכיבים. לבסוף, שינויים בפורמט הבדיקה הבסיסית נדונים כדי לאפשר להשתמש בו כדי לקבוע אינטראקציות חלבון-DNA עם אותם מצעים על ידי בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA).