Summary

Ein Ansatz zur Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden

Published: May 24, 2024
doi:

Summary

Hier wird ein schnelles und standardisiertes Verfahren zur Etablierung synergistischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus verschiedenen Rhizosphärenböden vorgestellt. Es handelt sich um ein einzigartiges Protokoll, das entwickelt wurde, um die komplexe Bodenmikrobiota der Rhizosphäre zu untersuchen und zu simulieren.

Abstract

Der Multispezies-Biofilm ist eine natürlich vorkommende und dominante Lebensweise von Bakterien in der Natur, auch im Rhizosphärenboden, auch wenn das derzeitige Verständnis dafür begrenzt ist. Hier bieten wir einen Ansatz an, um schnell synergistische Multispezies-Biofilmgemeinschaften zu etablieren. Der erste Schritt besteht darin, Zellen aus dem Rhizosphärenboden mit der Differenzialzentrifugationsmethode zu extrahieren. Anschließend werden diese Bodenzellen in das Kulturmedium inokuliert, um einen Pellikel-Biofilm zu bilden. Nach 36 Stunden Inkubation wird die bakterielle Zusammensetzung des Biofilms und der darunter liegenden Lösung mit der 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsmethode bestimmt. In der Zwischenzeit wird die bakterielle Isolierung mit hohem Durchsatz aus dem Pellikel-Biofilm mit der limitierenden Verdünnungsmethode durchgeführt. Dann werden die Top 5 der bakteriellen Taxa mit der höchsten Abundanz in den 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsdaten (Pellikel-Biofilmproben) für die weitere Verwendung bei der Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften ausgewählt. Alle Kombinationen der 5 bakteriellen Taxa wurden schnell mit einer 24-Well-Platte etabliert, die durch den Kristallviolett-Färbeassay für die stärkste Biofilmbildungsfähigkeit ausgewählt und durch qPCR quantifiziert wurde. Schließlich wurden die robustesten synthetischen bakteriellen Multispezies-Biofilmgemeinschaften mit den oben genannten Methoden erhalten. Diese Methodik bietet eine informative Anleitung für die Durchführung von Forschungen zum Multispezies-Biofilm der Rhizosphäre und die Identifizierung repräsentativer Gemeinschaften für die Untersuchung der Prinzipien, die die Interaktionen zwischen diesen Arten bestimmen.

Introduction

Biofilme stellen komplizierte mikrobielle Gemeinschaften dar, die entweder an Oberflächen befestigt oder mit Grenzflächen verbunden sind. Es ist allgemein anerkannt, dass die Mehrheit der Bakterien, die in verschiedenen Umgebungen, wie z. B. natürlichen Lebensräumen, klinischen Umgebungen und industriellen Kontexten, vorkommen, in Biofilmgemeinschaften überdauern1. Im Boden bildet die Rhizosphäre, die die Wurzeloberfläche und den angrenzenden 2 mm dicken Bereich umfasst, eine ökologische Nische mit erhöhter Nährstoffverfügbarkeit. Spezifische Bakterien haben Strategien entwickelt, um diese Nische zu nutzen, die mikrobielle Proliferation zu fördern und die Bildung von Biofilmgemeinschaften in der Rhizosphäre zu fördern2.

Rhizosphären-Mikroben gelten als das “zweite Genom” von Pflanzen3. Pflanzenwachstumsfördernde Mikroorganismen (PGPM) gehen eine mutualistische Symbiose mit Pflanzen ein und bieten so eine signifikante Wachstumsförderung und biologische Schädlingsbekämpfung4. Einerseits kann PGPM die Pflanzenwurzeln mit Nährstoffen versorgen, die Nährstoffaufnahme verbessern, Krankheitserreger abwehren und Schadstoffe im Rhizosphärenboden abbauen5. Auf der anderen Seite nutzt PGPM das Ausscheiden der Pflanzenwurzeln als Nährstoffquelle für Wachstum und Evolution und beeinflusst so den Rhizosphärenboden und das Wurzelsystem durch ihren eigenen Stoffwechsel. Es ist erwähnenswert, dass die Voraussetzung für all diese Funktionen die effektive Besiedlung von PGPM in der Pflanzenrhizosphäre ist, die stabile Biofilmebildet 6.

Der Rhizosphären-Biofilm beeinflusst den Assemblierungsprozess von Rhizosphären-Mikroben, und die zeitlichen und räumlichen Eigenschaften der Rhizosphären-Mikroben-Assemblierung stehen in engem Zusammenhang mit der Interaktion von Multispezies-Biofilmen7. Es dient als Drehscheibe für Pflanzen-Mikrobiom-Interaktionen und bietet eine stabile und kontrollierbare Nische, in der sie effektiv interagieren können. Daher ist die Untersuchung des Rhizosphären-Biofilms auch eine wichtige Richtung, um Einblicke in die Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben zu gewinnen.

Derzeit gibt es jedoch nur wenige Forschungen zu Multispezies-Biofilmen in der Rhizosphäre. Die hohe Komplexität der Zusammensetzung des Mikrobioms macht es schwierig, grundlegende ökologische Fragen rund um natürliche mikrobielle Gemeinschaften zu beantworten8. Bei den Experimenten müssen viele Bedingungen, wie z. B. die Bodenart, die Pflanzenart und die große Anzahl mikrobieller Gemeinschaften, berücksichtigt werden. Verschiedene Faktoren schränken die Erforschung von Rhizosphären-Multispezies-Biofilmen ein.

Um Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden weiter zu untersuchen, wie z.B. synergistische Wechselwirkungen zwischen den Spezies oder Metaboliten-Crossfeeding8, ist es wünschenswert, eine vereinfachte, repräsentative, stabile und handhabbare synthetische mikrobielle Gemeinschaft unter Laborbedingungen künstlich zu konstruieren 9,10. Hier kombiniert ein standardisiertes Protokoll mehrere der neuesten mikrobiologischen und bioinformatischen Techniken.

Protocol

Dieses Protokoll ist allgemein auf die Bodenmikrobiota der Rhizosphäre verschiedener Pflanzen anwendbar. Hier wird die Gurke als Beispiel verwendet. Einzelheiten zu den für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Isolierung von Bakterien Isolierung des RhizosphärenbodensGurkenkulturDie Gurkensamen werden mit 75 % Ethanol und 2 % Natriumhypochlorit (NaClO) desinfiziert und anschlie?…

Representative Results

Nach dem genannten Verfahren werden signifikante Gradienten in der Biofilmbildungskapazität der Gurken-Rhizosphären-Bodenmikrobiota beobachtet (Abbildung 1). Die Sequenzierung von Biofilm-Amplikonen bestätigte die Spezies im Pellikel (Abbildung 2). Basierend auf dem Heatmapping der Sequenzierungsdaten wurden die fünf wichtigsten Bakterienarten ausgewählt, deren Häufigkeit im Pellikel größer ist als die in der verbleibenden Lösung (A…

Discussion

Gemäß dem Protokoll wird eine Reihe robuster synthetischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aufgebaut, die auf der Mikrobiota im Rhizosphärenboden verschiedener Pflanzen basieren. Mit quantitativen PCR-Techniken wird die Zusammensetzung jeder Gemeinschaft eindeutig entschlüsselt. Die Biomasse des Biofilms deutet auf die Stärke ihrer potentiellen metabolischen Wechselwirkungen hin, wenngleich verschiedene Eigenschaften und Mechanismen hinter der Kooperation hier nicht aufgeklärt werden konnten19<…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (42307173 und 42107328) und dem National Key Research and Development Program (2022YFD1500202 und 2022YFF1001800). P.W, Z.X hat die Studie konzipiert. P.W, B.X, Z.C, J.X und N.Z analysierten die Daten und erstellten die Zahlen. P.W. schrieb den ersten Entwurf des Manuskripts. Z.X., R.Z. und Q.S. überarbeiteten das Manuskript.

Materials

0.2 % Na4P2O7 solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 20041418 Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. F613463-0001 Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. L03336903 Used to sterilize the seeds.
24-well Plate Merck & Co., Inc. PSRP010 Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) Bioolook Scientific Research Special 2360010 Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. 62.547.254 Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 801769680 Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd. D3350020000K04U021 Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I Nanjing Agricultural University N/A Black soil from Jilin Province.
Black Soil II Nanjing Agricultural University N/A Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2 Nanjing Agricultural University N/A Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10035048 Used to prepare MSgg media.
Centrifuge Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. G508009-0001 High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix Vazyme Biotech Co.,Ltd. Q311-02 Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. NB026143 Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd GNP-9080BS-Equation 1 Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. A600331 Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed Nanjing Agricultural University N/A "Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0 The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences N/A Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10011918 Used to prepare MSgg media.
Fridge Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd. BCD-556WKPM(Q) Used for strain preservation.
Glutamate Bioolook Scientific Research Special 2180020 Used to prepare MSgg media.
Glycerol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010618 Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket Yulv Furniture Store 6526262626 Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10017618 Used to prepare MSgg media.
MgCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 7791186 Used to prepare MSgg media.
MnCl2 Xilong Scientific Co.,Ltd. 10400101 Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd. BES20791KB Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O Merck & Co., Inc. S9390-100G Used to prepare TSB media.
NaCI Chinasun Specialty Products co., Ltd. HS0416 Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O Merck & Co., Inc. S9638-25G Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. E607008-0001 Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine RYON RT3486L005 Used to prepare MSgg media.
Pipette Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. BS-1000-T Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd. D102A Used to generate qPCR standard curves.
Pot Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. YHHWS2401 Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. N/A Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd. 4484073 Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary The Wellcome Trust SangerInstitute N/A Used to design primers of qPCR
Shaker Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd ZQTY-50S Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77 Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd. SL77080596 Used to prepare TSB media.
Soy peptone Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd HB8275 Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd. 76713100010 Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. SW150302 Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves Beijing Labgic Technology Co.,Ltd. 223016852LLZA Used for basic experimental operations.
Template DNA Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. N/A Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine Bioolook Scientific Research Special 2180020 Used to prepare MSgg media.
Tryptone Thermo Fisher Scientific LP0042B Used to prepare TSB media.
Tryptophan Bioolook Scientific Research Special 2190020 Used to prepare MSgg media.
TSB Medium Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd. 024048 Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium Nanjing Agricultural University N/A Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2 Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd C0310520123 Used to prepare MSgg media.

Referenzen

  1. Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere. Rhizosphere. , 11-34 (1990).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).
  5. Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).
  6. Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).
  7. Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).
  8. Sun, X., et al. Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions. ISME J. 16, 774-787 (2021).
  9. Pandhal, J., Noirel, J. Synthetic microbial ecosystems for biotechnology. Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).
  10. Grosskopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).
  11. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  12. Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528, 364-369 (2015).
  13. Bakken, L. R. Separation and purification of bacteria from soil. Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).
  14. Yang, O., et al. Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions. Soil Biol Biochem. 155, 108178 (2021).
  15. Ren, D., et al. High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions. Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).
  16. Sun, X., et al. Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities. mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).
  17. Zhang, J., et al. High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota. Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).
  18. Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation. ISME J. 9, 81-89 (2015).
  19. Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066 (2024).
  20. Palková, Z. Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature. EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).
  21. Xu, Z., et al. Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes. Curr Opin Microbiol. 72, 102269 (2023).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Wang, P., Xia, B., Chen, Z., Xie, J., Sun, X., Tian, Q., Gao, C., Xun, W., Zhang, N., Zhang, R., Shen, Q., Xu, Z. An Approach to Constructing Multispecies Biofilm Communities from Rhizosphere Soil. J. Vis. Exp. (207), e66926, doi:10.3791/66926 (2024).

View Video