Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos
Summary
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.
Abstract
Las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) son fundamentales para el correcto funcionamiento de la retina. La disfunción del EPR está implicada en la patogénesis de importantes enfermedades de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinosis pigmentaria y la retinopatía diabética. Presentamos un enfoque simplificado para el aislamiento del EPR de los ojos de adultos murinos. A diferencia de los métodos informados anteriormente, este enfoque permite el aislamiento y el cultivo de EPR de alta pureza a partir de ratones adultos. Este método simple y rápido no requiere una gran habilidad técnica y se puede lograr con herramientas y reactivos científicos básicos. El EPR primario se aísla de ratones de fondo C57BL/6 de 3 a 14 semanas de edad mediante la enucleación del ojo seguida de la extirpación del segmento anterior. La tripsinización enzimática y la centrifugación se utilizan para disociar y aislar el EPR de la copa ocular. En conclusión, este enfoque ofrece un protocolo rápido y eficaz para la utilización del EPR en el estudio de la función y la enfermedad de la retina.
Introduction
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa celular especializada que recubre la membrana de Bruch ubicada entre los fotorreceptores y la coroides1. Las células EPR desempeñan un papel fundamental en el correcto funcionamiento de la retina. Las células EPR transportan glucosa y vitamina A a los fotorreceptores, promueven la visión mediante la reisomerización de todo el retinal trans en retinal 11-cis y mantienen los segmentos externos del fotorreceptor a través de la fagocitosis de los segmentos externos desprendidos, eliminan el agua del espacio subretiniano, forman la barrera hematorretiniana externa a través de la presencia de uniones estrechas y secretan factores de crecimiento neurotrópico (como el factor derivado del epitelio pigmentario, y Factor Básico de Crecimiento de Fibroblastos) que apoyan los fotorreceptores2. La disfunción de las células EPR está involucrada en la patogénesis de diversas retinopatías, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad, la retinosis pigmentaria y la retinopatía diabética 3,4,5. Los estudios in vitro con células EPR son fundamentales para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de estas enfermedades. Las células primarias del EPR son las preferidas para estos estudios, ya que las líneas celulares del EPR, aunque están fácilmente disponibles, carecen de las características clave de las células primarias del EPR.
Mientras que varias especies se han utilizado como fuentes de células primarias de EPR, los ratones tienen la ventaja de utilizar modificaciones genéticas para ayudar a comprender la patogénesis de las retinopatías. Los protocolos previamente descritos para aislar células EPR de roedores requieren el uso de animales neonatos, son largos, requieren habilidad técnica o no son adecuados para el cultivo 6,7,8,9,10,11,12. Describimos un método simple y rápido para aislar células EPR de ratones adultos que producen cultivos altamente puros de estas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, hemos esbozado un protocolo simplificado para el aislamiento y cultivo del epitelio pigmentario de la retina murina. Las células EPR aisladas de los ojos de ratones adultos expresaron un marcador específico de EPR, RPE65, y un marcador de unión intercelular, ZO-1. Además, las células cultivadas se desarrollaron en láminas hexagonales pigmentadas durante el cultivo.
Anteriormente se han publicado varios métodos para el aislamiento de EPR en roedores</…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (C.S.S.), NIH Grant F31EY035156 (A.H.) y P30 EY011373. La organización financiadora no participó en el diseño ni en la realización de esta investigación.
Materials
| 0.009 RD Single-Edge Blades | Personna | 941202 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum | Corning | 35010CV | |
| GlutaMAX, 100x | Gibco | 35050061 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | no Calcium, no magnesium, no phenol red |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100x | Gibco | 11140050 | |
| Micro-Unitome Knife | BVI Beaver | 377546 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyrene Microplates | Falcon | 08-772-1 | 24-well or 48-well |
| Regular Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | with phenol red |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 10091-12 |
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